El penúltimo artículo y primera incursión en peces

Siguiendo con la puesta al día del blog, presentamos el penúltimo artículo (el último está en el horno) y primero en peces. Allá por Marzo de este año, empezábamos a esbozar las primeras ideas en torno al locus genético de las inmunoglobulinas del pez espinoso, evolución rápida, regiones V y su agrupamiento en familias, nuevos anticuerpos... y finalmente el resultado ha sido la publicación en Developmental and Comparative Immunology en Septiembre de este año con el título de "Presence of an unique IgT on the IGH locus in three-spined stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) and the very recent generation of a repertoire of VH genes". Espero que disfrutéis este sustancioso trabajo donde por ejemplo se concluye que la IgZ del pez zebra y la IgT de la trucha arcoiris y otras formas descritas posteriormente (IgZ/T), como en la Siniperca chuatsi, tienen una clara relación evolutiva y pueden ser agrupados bajo una misma clase de anticuerpos, y también que la rápida generación del repertorio VH puede tener relación con la adaptación de los peces a nuevos hábitats, constituyendo un modelo biológico que aclare los procesos evolutivos que originan los genes de inmunoglobulinas.

En la próxima entrada espero colgar el link del siguiente artículo ;)

Presentación de la charla "Origen evolutivo de los anticuerpos" por el Dr. Gambón Deza

La charla tuvo lugar en el IEO de Vigo en Noviembre de este año y en ella se hace un repaso al origen evolutivo de los anticuerpos, destacándose como conclusión que existe una similitud en la organización del locus genético para las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas (IGH) en reptiles, anfibios y mamíferos, lo que sugiere que la reorganización genómica de este locus fue anterior al origen de los vertebrados tetrápodos.

El trabajo en su origen se planteó desde la necesidad de procesar y obtener el mayor conocimiento posible de los genomas de vertebrados que están siendo publicados (en la actualidad hay 16 genomas introducidos en bases de datos de uso público) y más concretamente, poder dilucidar cómo han evolucionado genes importantes para el funcionamiento del sistema inmune, como los de las inmunoglobulinas.

Se relata que en el inicio del proyecto sólo existían datos relacionados con la estructura del locus IGH en mamíferos, anfibios y algunos peces teleósteos, sin embargo, no existían trabajos que analizasen dicho locus en reptiles, los cuales representan un nexo evolutivo muy importante entre animales acuáticos y mamíferos terrestres.

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El origen evolutivo de la inmunoglobulina A

Hace dos años propusimos que la IgA tiene un origen por recombinación de la IgM y la IgY. Esta idea surgió como consecuencia del estudio de un anticuerpo nuevo encontrado en Eublepharis macularius que claramente era originario por este proceso de recombinación. En un principio cuando no sospechábamos de esta recombinación las búsquedas en el BLAST con su secuencia nos indicaba que era un anticuerpo similar a la IgX de Xenopus. Todo esto desencadenó la hipótesis de que todas las inmunoglobulinas A podrían tener un origen similar. Después de estudiar multitud de anticuerpos seguimos creyendo que el origen de la IgA se produce por este proceso de recombinación. Pero una cuestión que es importante es que las IgAs de cada clade evolutiva (aves, mamíferos y geckos) se ha producido por un proceso de recombinación diferente. Es decir, durante el proceso de evolución ha ocurrido varias veces la recombinación entre la IgM y la IgY, siendo las IgA encontradas en la actualidad descendientes de estos procesos de recombinación. Por lo tanto no existe un único proceso de recombinación que diera todas las IgA.

Cuando publicamos el artículo pensamos que los datos eran de interés. Era necesario esperar un tiempo para comprobar si otros grupos de investigación tomaban esta hipótesis como suficientemente plausible para poder discutirla. Han salido en estos momentos dos artículos del Dr. Zhao en el J. Immunol. En el que presentan trabajos muy similares a los nuestros realizados en Anolis carolinensis y en el ornitorrinco. En los resultados no existen contradicciones con lo publicado por nosotros. Nos agrada que vean plausible que el origen de la IgA sea por origen de recombinación, dándo apoyo a nuestra hipótesis.

Coevolución de los genes de las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos

Quizás uno de los procesos más interesantes de coevolución a nivel genómico sea él de la evolución de las cadenas que componen los anticuerpos. En los peces cartilaginosos los anticuerpos ya tienen cadenas pesadas y cadenas ligeras. Tanto las unas como las otras están constituidas por dominios inmunoglobulina lo que indican un origen común. Por lo tanto los anticuerpos parece que desde un primer momento ya estaban constituidos por ambas cadenas. El hecho que el lugar del unión al antígeno está conformado por las regiones variables de ambas cadenas quizás haya constituido la mayor presión evolutiva para el mantenimiento de una estructura similar.

Pero el sistema tiene incongruencias. En un principio parece que debió haber múltiples cadenas ligeras, tan es así que los peces parece que tienen cuatro tipos de estas cadenas. Posteriormente en los animales que pasaron la tierra hubo una disminución existiendo solamente tres en los anfibios, dos en reptiles y mamíferos y una en aves. El hecho de que existan varias no encontramos una explicación a nivel evolutivo por que no se ha encontrado ninguna diferencia en la funcionalidad de un anticuerpo tenga una cadena variable o tenga otra. Quizás la clave esté en el repertorio de estas cadenas. Así en mamíferos suele ser muy común el uso predominante de las cadenas kappa mientras que en reptiles probablemente se use mas la cadena lambda.

También quedan muchas respuestas sin contestar. ¿Por qué las cadenas kappa únicamente tienen un isotipo?. ¿Por qué las cadenas lambda casi siempre tienen tres isotipos?. En las cadenas Lambda es de interés el mantenimiento de la secuencia de aminoácidos en cada uno de los isotipos de estas. Así que presentan tres isotipos que a su vez, a nivel genómico debe de haber intercambios recombinacionales que mantengan la secuencia prácticamente idéntica entre ellos.

Lo más lógico hubiera sido la existencia única de una de las cadenas como ocurre en las aves. El hecho del mantenimiento de como mínimo dos cadenas ligeras sugiere la necesidad de preservarlas. La pérdida de una de estas cadenas deberían llevar a la creación de agujeros en el repertorio que en algún determinado momento condicionarían en la viabilidad del individuo. Quizás esto contribuya a la explicación de la aparente " mala inmunidad" de las aves.

Tambien queda la cuestion de si guia una a la otra en la evolución. ¿Es mas fundamental la pesada que la ligera?¿Es mas básica la kappa que la lambda?. El interes de estas cuestiones viene en que si se demostrara la importancia de alguna de ellas sobre las otras implicaría la depencia evolutiva.

400 millones de años, duplicaciones y creatividad

Los peces y los animales que pasaron a tierra llevan 400 millones de años evolucionando de forma independiente. Ademas los ambientes también son totalmente diferentes, unos evolucionan en un medio acuatico y los otros sobre la superficie o el aire.

El sistema inmune con los anticuerpos aparecieron con la generación de los vertebrados hace unos 540 millones de años. La estructura de los anticuerpos de entonces no ha variado considerablente (sobretodo considerando la IgM). Durante 150 millones de años la evolución fué en medios acuáticos y fué entonces cuando algunos animales salieron fuera del agua. Los animales que quedaron en el agua parece que se dedicaron a duplicar los genes de los anticuerpos una y otra vez. En estos procesos de duplicación y recombinación se fueron formando variaciones de la estructura inicial que debieron de ser seleccionadas o no. La teoría de nacimiento y muerte de genes puede aplicarse a estos casos.

En los animales que pasaron a tierra la evolución cambió. Duplicaciones ha habido pero han sido menos frecuentes. Lo que ha tenido éxito han sido las recombinaciones que han creado nuevos genes como la IgA y duplicaciones con evolucion divergente como la IgY y sus derivadas IgG e IgE.

El cuadro que emerge del estudio de los locus genéticos de los anticuerpos evidencia el predominio de las duplicaciones en los genes de los peces y la creatividad de nuevos anticuerpos en los animales que pasaron a tierra.

¿Porque los reptiles han mantenido regiones V durante tanto tiempo?

La teoría de nacimiento y muerte para explicar el origen, la diversificación y la desaparición de regiones V parece que se cumple en la mayoría de las especies. Es muy clara en peces, existiendo algunos casos como el que hemos descrito en el pez espinoso que este proceso debe ocurrir a una gran velocidad. También parece que en mamíferos debe ocurrir un hecho similar ya que hay algunas especies que prácticamente la mayor parte de sus genes V se corresponden con unas pocas familias de un mismo clan. Con estos datos se podría concluir que ha de quedar muy poca memoria de la región V que hubo en los primeros momentos en que se generaron los vertebrados y en el momento en que éstos pasaron a tierra.

Por lo tanto los datos que hemos obtenido de reptiles tanto en la región V de la cadena pesada como la región V de la cadena Lambda son significativos. El hecho de encontrar genes que probablemente no han debido sufrir grandes cambios durante el proceso evolutivo y que además no han sufrido procesos de duplicación nos dan una imagen de cómo debieron ser estos genes en un momento posterior a la salida de los vertebrados a tierra. ¿Porque se han mantenido? cuando estudiamos los peces y describimos que existe una gran velocidad evolutiva en la generación de regiones V propusimos que puede que exista un mecanismo biológico que condicione la diversificación de estas regiones. Una explicación del mantenimiento quizás podría ser que este mecanismo se haya perdido en los reptiles. En realidad la cosa es más complicada ya que junto con regiones V que se han mantenido durante mucho tiempo coexisten otras V que han creado familias con generación reciente.

Otra interpretación posible podría ser la fijación de procesos de respuesta inmune. Me explico. Quizás alguna de las regiones variables tengan una importancia fundamental en la respuesta inmune frente a un germen del ambiente con gran efecto en la supervivencia del reptil. Esta región V no debería ser en ningún momento perdida mientras la amenaza ambiental subsistiera. Además debería haber alguna presión evolutiva para que esta región no se diversificará o se diversificará lo mínimo generando familias de uno o muy pocos miembros.

La primera hipótesis sería necesario demostrar el mecanismo que genera la diversificación de las regiones V mientras que para la segunda trabajo experimental se puede hacer, aunque no en un futuro próximo.

Duplicaciones en el locus IGH y el método de reproducción

Tanto en el pez espinoso como en el medaka existen procesos de duplicación génica que han ocurrido recientemente. Estas duplicaciones que hemos encontrado en los genes para los anticuerpos puede que sea un proceso que ocurra en otros genes. Un proceso de esta magnitud parece que no se corresponde con lo encontrado en las especies que pasaron la tierra. En mamíferos podemos encontrar duplicaciones recientes de un gen concreto de anticuerpos (IgG en humanos o IgA en conejos) pero no divisiones sucesivas y aditivas del locus y IGH completo.

Aunque se puede argumentar que el locus IGH en humanos se ha duplicado en periodos relativamente recientes, esto no es comparable con lo que hemos encontrado en los peces anteriormente mencionados. La duplicación en el locus humano ocurrió una sola vez y ha habido cambios importantes, encontrando la secuencia totalmente cambiada en las zonas intronicas y abundantes cambios en los exones de los anticuerpos que quedaron viables. En los peces las secuencias de los segmentos duplicados son prácticamente idénticas sugiriendo que la duplicación es extraordinariamente reciente.

¿Cómo podemos explicar estos procesos de duplicación tan frecuentes en peces?. La solución puede que esté en el método de reproducción. Los peces se reúnen produciendo un enorme desove de millones de huevos que a su vez se juntan con machos que producen millones de espermatozoides. En este proceso de fecundación se producirán millones y millones de zigotos sobre los que actuará la selección natural. El hecho de que en cada acto reproductivo se produzca una prole tan inmensa evidencia que muchos individuos presentarán variaciones genéticas que serán testadas por el ambiente y a su vez seleccionadas. Por lo tanto los procesos evolutivos que tienen que ser mucho más rápidos en peces que en mamíferos. Estos últimos generan una prole mínima la cual es ayudada por sus progenitores a sobrevivir. Es evidente que el mecanismo evolutivo en los animales terrestres y acuáticos cambian a partir de que cambian los métodos reproductivos.

La generación de la diversidad de los anticuerpos en reptiles

En aves y mamíferos existe una diferencia sustancial en la generación de especificidades de los anticuerpos. En mamíferos la creación de esta diversidad está muy estudiada. Se basa fundamentalmente en la elección aleatoria de genes V, D y J. Este proceso ocurre tanto en las cadenas pesadas como en las cadenas ligeras. Los mamíferos tienen dos cadenas ligeras diferentes (kappa y lambda) mientras que las aves únicamente tienen cadenas ligeras lambda.

En las aves cada una de las cadenas del anticuerpo solamente utiliza una región V. esta región V es diversificada por procesos de recombinación con regiones V que se encuentran "upstream" de la usada. Este fenómeno ocurre tanto en las cadenas pesadas como en la cadena ligera.

Los reptiles van a utilizar el sistema de mamíferos. Además presentan las mismas cadenas ligeras que tienen los mamíferos. Por lo tanto el sistema de diversificación de los anticuerpos de las aves es propio de ellas y no ha sido delegado de los reptiles.

Otros procesos de diversificación como la unión desigual V-D-J, la adición de nucleótidos N y P y la mutación somática también se pueden estudiar. En principio con los datos presentes en el genebank creemos que podemos hacer el estudio detallado y responder a la pregunta de si los procesos de diversificación más sofisticados de los mamíferos estaban ya presentes en los reptiles.

Mas VH en Anolis carolinensis

En el estudio que hicimos del locus IGH de Anolis carolinensis encontramos 61 regiones VH. En el scalfold 731 fue donde encontramos la mayoría de ellas. Debido a que en los extremos encontramos genes que ya no correspondían a genes de anticuerpos creímos que aquí acababa el locus. Ha sido una sorpresa al revisar los datos de que pasados varios genes para el receptor vomeronasal siguen apareciendo genes VH. A día de hoy he encontrado unos 40 genes adicionales. Por lo tanto habrá que hacer una segunda versión del mapa y reeditar todas las secuencias y comprobar la composición de los grupos y familias de regiones VH.

Es importante estudiar cómo se genera la diversidad de los anticuerpos en lo reptiles. Existen bastantes indicios de que los genes de los anticuerpos de estos animales no han cambiado mucho en los últimos 300 millones de años. Las VH de los mamíferos se han generado muy recientemente y no quedan restos de aquellas que les debieron dar origen. Algunas de las VH de Anolis carolinensis parece que se corresponden con aquellas que existían en los tiempos en que se generaron los reptiles.

Las VL de las aves

En el pollo se ha descrito la generación de la diversidad de los anticuerpos mediante un proceso particular. Tanto en las cadenas pesadas como las cadenas ligeras solamente existe un gen VL viable. El resto de los genes variables se consideran pseudogenes que donan parte de su secuencia para generar la diversidad mediante recombinación con el gen VL viable. A pesar de que este hecho esta muy descrito en el pollo no está claro si va a ocurrir lo mismo en todas las especies de aves. También se producen cuestiones evolutivas. Un pseudogen tiene un tiempo de vida evolutivo limitado debido a la imposibilidad de expresarse. Esto condiciona la no selección de esta secuencia con permisividad para mutaciones y delecciones que acabaran borrando el gen.

Las aves parece que solamente tienen cadenas ligeras Lambda. Esto nos puede ayudar para reestudiar este fenómeno en la actualidad con los locus completos del pollo y el zebra finch. Además otra cuestión que queda pendiente es si la capacidad de generación de diversidad en el pollo se ha generado en la línea evolutiva de las aves o es heredado de los reptiles. En los reptiles hemos encontrado que presentan cadenas kappa y lambda. Su descripción y análisis detallado en los siguientes días nos darán la solución.

Como hacer investigación

Hay un cambio en la metodología de investigación. Los trabajos de laboratorio siempre han conllevado la necesidad de una gran cantidad de aparataje, reactivos y manipulación para la realización experimentos. La mayor parte del tiempo es dedicada a la realización del experimento mientras que la actividad intelectual de su preparación y análisis duraban menos. En la actualidad con la aparición de la automatización de los laboratorios y nuevas máquinas que generan enormes masas de datos se crea una nueva actividad investigadora mucho más fácil y satisfactoria. En estos momentos se están generando muchos más datos de los que el sistema puede analizar. Además esta situación tiene visos de perdurar sobre todo en biología ya que en los siguientes años probablemente puedan ser secuenciados (su DNA) de todos los seres vivos.

Parece que en otras ciencias también está ocurriendo lo mismo. En física y astronomía todos los datos que se obtienen de observaciones son introducidos igualmente en Internet.

Una visión inteligente de aquel que se incorpora a las labores de investigación debería aprovecharse de esta situación. Los datos están en Internet y el aprendizaje de su obtención y manipulación le darían una gran ventaja. Si continúa por el método clásico no le queda más camino que realizar un duro trabajo para obtener financiación y la ejecución experimental de laboratorio, siendo necesario probablemente tres años de trabajo para obtener uno o dos artículos con suerte.

¿Se cumple la teoría de la selección clonal en teleósteos?

Parece que en muchas especies de peces teleósteos existen más de un locus IGH. A pesar de que muchos de los genes parece que van a ser pseudogenes puede que existan más de una IgM funcional. Además es posible que ocurran varios procesos de reagrupamiento asociados a cada una de las zonas en que se encuentran las VH-DH-JH. Esto conlleva a la idea de que un mismo linfocito podría expresar dos anticuerpos diferentes.

Uno de los conceptos básicos en que se sustenta la teoría de la selección clonal es el de una célula un anticuerpo. Tardó muchos años en demostrarse pero al final quedó claro. Desde luego en humanos y en roedores está muy demostrado. Desde que este concepto fue asimilado. inconscientemente lo hemos aplicado a todo el proceso evolutivo de los anticuerpos, pero quizás algunas líneas evolutivas lo podrían haber perdido como en el caso de los peces teleósteos. En aquellos peces en que se demuestre la existencia de dos IgM funcionales es necesario hacer experimentos para confirmar si se producen más de un reagrupamiento génico y si a la vez se conforman más de un anticuerpo por celula.

Cambio genómico inducido

Para que los seres vivos puedan evolucionar es necesario que ocurran cambios en su genoma. Existe un consenso de que los cambios fundamentales en los genes son la mutación y los procesos de recombinación que conllevan a duplicaciones y conversiones génicas. Además puede que los trasposomas también intervendrán en los procesos de duplicación génica.

Los cambios en el genoma siempre se han considerado un proceso accidental estocástico. La mutación somática siempre se ha descrito como un proceso aleatorio que tiene una tasa de ocurrencia por unidad de tiempo. Los procesos de duplicación génica igualmente son considerados accidentes mayores. Todos estos accidentes curiosamente se consideran los actos fundamentales de la evolución. Sobre las nuevas formas fenotípicas que generen estos cambios del genoma actuará la selección natural, que condicionará el mantenimiento o la desaparición de lo originado tras el accidente.

Por lo tanto es difícil pensar que haya cambios genéticos programados o estructurados en la actividad biológica de los seres vivos (esto sería lo contrario a lo accidental o casual). Sin embargo dentro de la propia teoría evolutiva se considera que la diversidad es necesaria para que exista evolución. Contra mayor diversidad mayor evolución se desarrolla. Por lo tanto sería lógico pensar que la propia selección natural condicionará la existencia de procesos de variación genética que dieran diversidad a grupos de seres vivos. Así podrían ocurrir cambios genéticos a consecuencia de mecanismos biológicos existentes en los propios seres vivos que facilitarán una evolución adaptativa. Esto último es muy factible que esté ocurriendo en la zona genética que codifica para la regiones VH. Lo que hemos visto en el pez espinoso de la generación rápida de un repertorio podría ser un paradigma de este fenómeno. Sería interesante estudiar y buscar si hay algo encerrado en las secuencias de estas zonas para poder intentar deducir el proceso biológico subyacente.

Normas evolutivas

Durante muchos años la evolución se consideró consecuencia de pequeños cambios genéticos accidentales, que posteriormente entran en el proceso de selección natural. Cuando se descubrió la mutación somática, ésta engranó perfectamente con estas ideas y con los conceptos gradualistas en la evolución. Así un gen que codifica a una proteína irá sufriendo mutaciones, algunas de las cuales (la mayoría) son irrelevantes, mientras que un pequeño número tendrán efectos beneficiosos o negativos dentro del contexto selectivo. Prácticamente la base genética de la evolución se basó en esta concepción.

La secuenciación de numerosos genes evidenció la presencia de las familias supergénicas. Estas familias únicamente se pueden entender como consecuencia de un proceso de duplicación de genes durante la evolución. Estos datos ya indican procesos de cambio nivel del DNA muy superiores a los predichos exclusivamente por la mutación. En los últimos años con la secuenciación de los genomas se ha añadido la presencia de los transposomas. Probablemente estas secuencias deben ayudar al proceso de recombinación y duplicación de genes.

En los peces teleósteos se evidencian procesos de duplicación múltiples de los anticuerpos. En la línea evolutiva de los animales terrestres, los procesos de duplicación parecen ser más esporádicos. A pesar de eso se podrían llegar a conclusiones de que en el proceso evolutivo de los anticuerpos existen una serie de normas o leyes que nunca se han alterado. Una primera norma es clara:

- Todos los vertebrados presentan IgM (anticuerpo con cuatro dominios inmunoglobulina con segmentos JH en su región 5').

Una segunda norma también es clara aunque más difusa:

- Todos los vertebrados presentan un anticuerpo en la región 3' de la IgM.

Una tercera:

- Los los genes de los anticuerpos tienden a combinarse o duplicarse generándose nuevos anticuerpos. Este proceso siempre ha de dejar una IgM integra, mientras que el resto que los anticuerpos puede variar ampliamente.

¿Porque todo esto es así?. La IgM debe jugar un papel principal. Todos los procesos que condicionen su eliminación son letales. No ocurre lo mismo con el resto de anticuerpos, pudiendo estos combinarse para generar otros anticuerpos que pudieran dar ventajas evolutivas. Estas no tienen que ser obligatorias para el mantenimiento de la viabilidad del individuo sino que le dan una ventaja evolutiva que facilitan su supervivencia.

la baraja de exones en el medaka

El locus IGH del medaka parece complejo y confuso pero puede que todo sea simple. Lo de complejo y confuso viene por el hecho de que se encuentran numerosos exones para codificar genes de cadenas constantes, pero no queda claro que el conjunto de estos exones puedan codificar un anticuerpo real. La situación es tan confusa que es mejor clasificar las 500,000 pares de bases que componen el locus en zonas. Existen cinco zonas claramente delimitadas con exones que codifican para las regiones constantes de anticuerpos. En estas zonas hay exones para codificar una o dos IgM y probablemente una IgD. Pongo una figura con el esquema de la Zona 2 que es muy similar al resto que los otras 5 zonas. Como puede verse detrás de tres exones de IgM hay un exon de IgD y de nuevo vuelve haber exones de IgM y de nuevo exones de IgD. La conclusión es que varios de estos exones parecen haberse barajado. A pesar de toda esta organización de exones no he podido encontrar ninguna EST con estas secuencias, indicando que probablemente la Zona 2 no codifique a ningún anticuerpo real.

Ha habido por lo tanto procesos de duplicación y recombinación múltiples que no han debido generar una organización genética viable para producir un anticuerpo real. Este proceso ha ocurrido hace tan poco tiempo que los exones tienen secuencias idénticas no existiendo ninguna mutación. Por lo tanto no llegan a ser funcionales probablemente porque se han perdido secuencias regulatorias o estructurales necesarias para el proceso de transcripción.

IgM especial en el medaka

Una mirada general al locus IGH del medaka (Oryzias latipes, en la imagen únicamente un trozito del locus) evidencia una distribución de los genes de los anticuerpos y exones que va a ser difícil de interpretar. Existe procesos de duplicación de largos segmentos de la secuencia y parece que ahí únicamente dos clases de anticuerpos IgM e IgD (aunque puede haber tres o cuatro isotipos de cada una de ellas). Pero tanto la IgM como la IgD tienen peculiaridades.

Existe una IgM de aspecto normal con cuatro dominios de inmunoglobulinas y que supongo que será la fundamental del pez (no es la expresada en el gráfico). A su vez existen otros genes conformados por dominios de inmunoglobulina de IgM pero son genes con únicamente tres dominios (sería el primer caso de una IgM de tres dominios). La cosa se complica cuando he determinado que el dominio que falta es el CH3 (en un anticuerpo siempre que falta un dominio el ausente es el CH2). Para complicar más la cosa he buscado las base de datos EST y encontrado que el RNA mensajero de estos genes de tres dominios de IgM solamente tienen dos (los correspondientes a los dominios CH1 y CH2). Así que el gen de la "IgM especial" del medaka (quizás haya que ponerle un nombre propio) está conformado por dominios de IgM 1, 2 y 4. Además tras ellos existe en dos dominios trasmembrana (sorprendentemente cada uno de los dominios codifica para una hélice alfa hidrofóbica). Este gen genera un RNA mensajero con los dominios 1, 2, TM1 y TM2. Este anticuerpo no se parece a ningún otro anticuerpo publicado. Todas las EST que encontraron son de membrana (parece que no existe forma secreta). Tampoco he encontrado ninguna EST que tuviera el dominio 4.

La cosa no acaba aquí. Existen en el locus dominios de IgM sueltos o interpuestos entre los dominios de la IgD. La conclusión que saco de forma provisional es que en este locus ha debido ocurrir recientemente una catástrofe con un gran número de recombinaciónes en la cual se han destruido y se han creado nuevos genes. Probablemente debió de ocurrir hace poco tiempo y no ha dado tiempo a la mutación estocástica evolutiva a ir borrando los exones que han caído dentro de zonas no codificantes. Es la única forma de poder explicar la existencia de exones perfectos pero que no pasan a RNA mensajero.

Es necesario algo de tiempo para madurar estas ideas o cambiarlas. El estudio no está en absoluto completo.

Duplicaciones en el locus IGH del medaka

Al igual que en el pez espinoso en el medaka también existen un gran número de duplicaciones de amplios segmentos de DNA genómico dentro del locus genético de las cadenas pesadas de los anticuerpos. Estas duplicaciones son recientes y han generado un gran número de isotipos de los cuales algunos de ellos puede que no sean funcionales. Más aún, en el medaka, parece que el proceso ha sido caótico. Aparecen IgMs con tres dominios en los que se ha perdido el CH3 (hasta ahora no existe otro ejemplo en la literatura) y además ahí exones sueltos que probablemente no se expresen en RNA mensajero. La explicación de estos exones sueltos es sugestiva de una generación muy reciente y que no han existido tiempo para inducir cambios mutacionales significativos. Por lo tanto en el estudio del locus genético del medaka va a ser muy importante saber cuál de los isotipos son realmente funcionales y significativos en la respuesta inmune. Por otro lado nos puede ayudar a entender lo que ocurre en los procesos evolutivos. Debido al amplio número de duplicaciones y la generación de diferentes formas de isotipos se puede deducir las formas posibles que puede tener un anticuerpo. Sobre esto hay datos interesantes que se mencionaran en otros post.

¿Porque el pez espinoso y el medaka tienen triplicaciones en el locus IGH?. Una explicación podría ser que el proceso de tiplificación hubiera sido único y ocurriera antes de la divergencia de las dos especies. Esto no puede ser posible..... las diferencias de secuencia en cada una de las clases de anticuerpos entre las dos especies son mayores que las diferencias de secuencia entre los isotipos de la misma especie. La conclusión que se obtiene es que el proceso de triplicación ha ocurrido de forma independiente en cada una de las dos especies. Por lo tanto la tendencia a la multiplicación de los anticuerpos es un proceso que abarca por lo menos a estas dos especies y queda descartado que sea un acto estocástico casual. ¿Tiene algo que ver el proceso biológico que induce la diversificación de las regiones VH?. Quizás un análisis detenido nos pueda ayudar a contestar estas preguntas.

Una paradoja evolutiva en la IgM

He estado buscando el origen evolutivo de la IgT/Z. En un principio me pareció muy plausible que se correspondiera con una duplicación simple de la IgM. El hecho de que también tenga regiones J apoyaría esta sospecha. Para confirmarla obtuve múltiples secuencias IgM desde peces cartilaginosos hasta mamíferos. A todas las secuencias eliminé la secuencia correspondiente a la codificada por el exón CH1 ya que tenemos una sospecha clara de que este exón es intercambiado durante el proceso evolutivo.

El árbol filogenético tal como sale no confirma la hipótesis anteriormente mencionada. El árbol también da resultados conflictivos. El más sorprendente es que la IgM de los animales terrestres procede evolutivamente de la IgM de los peces cartilaginosos. Esto podría indicarnos que es una falsedad inducida por el árbol, pero el problema que tengo es que hay otros datos que apoyan esta hipótesis. Los datos proceden del estudio de la IgD. La IgD de los peces teleósteos parece que no tiene relación evolutiva con la IgD de los animales terrestres, y en cambio la IgW y IgNARC si que la tienen. Además el pez pulmonado tiene IgW. Otro dato que confirma lo anterior es el hecho de que la IgY también parece proceder de los cuatro primeros dominios de la IgW. Tambien la IgM del pez pulmonado se coloca perfectamente entre la IgM de los cartilaginosos y los animales terrestres.

Las bases de datos EST

Cuando empezamos a realizar el estudio del locus IGH de Eublepharis macularius todo lo teníamos que hacer nosotros. Extraer DNA y RNA, realizar PCRs y RT-PCRs y posteriormente secuenciar los productos. Ahí no acababa el trabajo; las secuencias fueron sometidas al paso por múltiples softwares para sacar la información relevante.

En la actualidad ha cambiado todo. El trabajo manual y experimental de laboratorio ha desaparecido. Gente con impresionantes máquinas secuencian el genoma completo de diferentes especies y dejan estas secuencias para su uso público. Incluso esta secuencias son introducidas y pasadas por diferentes softwares intentando sacar la información relevante. En la actualidad sólo queda una cosa que es lo que estamos haciendo nosotros. Personas que tienen conocimientos sobre el tema revisan los datos y ordenan la información para la realización de la publicación científica.

Hago esta reflexión debido a que he introducido en los estudios las bases de datos EST. En el trabajo experimental que realizamos con Eublepharis macularius una de las partes más complicadas era el trabajar con RNA. Esto lo hacíamos para ganar confianza en las predicciones génicas que habíamos hecho a partir de las secuencias del DNA genómico. Como todos los genes eran definidos informáticamente era necesario la secuencia del RNA mensajero para confirmar los límites exón-intron y las diferentes formas probables del gen. En la actualidad la totalidad de proyectos de secuenciación de un genoma se acompaña de una secuenciación de EST (en realidad no sé lo que significan estas siglas). Lo que sí he visto es que son secuencias de cDNA de diferentes tejidos. Por lo tanto para nosotros esto cierra el círculo. Podemos hacer el estudio de un locus genético identificando los genes informáticamente y posteriormente confirmar estas predicciones mediante el estudio de las secuencias ESTs del proyecto. En una palabra han logrado hacer digital una cantidad enorme de trabajo manual

El medaka (Oryzias latipes)

Ya hemos llegado al final del estudio de G. aculeatus. En él hemos descrito una nueva forma de la IgT y sus orígenes evolutivos y además hemos evidenciado la existencia de un mecanismo biológico que induce la diversificación de los genes VH. Comenzamos el estudio con otro pez llamado "Medaka" (Oryzias latipes). Es un pez muy pequeño del sudeste asiático y habita tanto ríos como océanos. Puede que tenga una distancia evolutiva de aproximadamente 180 millones de años respecto al pez espinoso lo cual puede poner a prueba las hipótesis que hemos realizado con este último sobre la evolución de los anticuerpos. He localizado en el cromosoma ocho el locus IGH. Tiene un tamaño muy grande e igualmente se encuentran barajadas las regiones constantes y las regiones VH. En un primer análisis y ya se detectan zonas de interés. Tiene una combinación de IgZ más IgD sin la presencia de IgM (nunca se había descrito este hecho). Además aparecen unas IgD  extremadamente cortas con solamente tres dominios de inmunoglobulina. También hay una IgD muy larga pero existe un "exon suffling" de la IgM........ etc... Tenemos mucho trabajo para poder entender lo que hay en este locus.

La IgZ/T de G. aculeatus a fondo

Hoy estoy buceando por la web introcudiendo 363 aminoácidos de esta inmunoglobulina aquí y allá en las diferentes herramientas on line disponibles, estudiando los puntos de glicosilación, que por cierto solo hay 3 posibles (muchos menos de lo que estamos acostumbrados con otras proteínas hasta ahora), también prediciendo los puentes disulfuro entre las cisteínas... y la figura caracterizando todo esto comienza a tomar forma. Aprovecho para hacer referencia a una nueva herramienta en el ExPASy de estudio de mutabilidad relativa, la verdad es que te das cuenta de que todos los programas relacionados con evolución, filogenia... al final se basan en lo mismo, no es lo mismo una mutación que conlleve un cambio en la traducción de una cisteína que de una alanina y por tanto esto se puede relacionar matemáticamente con una escala de valores que pego a continuación y obtener una gráfica de tu secuencia de interés (en este caso la IgZ/T que también os la muestro al final) y analizar los puntos débiles y fuertes en relación a su susceptibilidad de cambio:

ProtScale Tool

Amino acid scale: Relative mutability of amino acids (Ala=100).

Author(s): Dayhoff M.O., Schwartz R.M., Orcutt B.C.

Reference: In "Atlas of Protein Sequence and Structure", Vol.5, Suppl.3 (1978).

Amino acid scale values:

Ala:100.000
Arg:65:000
Asn: 134.000
Asp: 106.000
Cys: 20.000
Gln: 93.000
Glu: 102.000
Gly: 49.000
His: 66.000
Ile: 96.000
Leu: 40.000
Lys: 56.000
Met: 94.000
Phe: 41.000
Pro: 56.000
Ser: 120.000
Thr: 97.000
Trp: 18.000
Tyr: 41.000
Val: 74.000

Modificaciones en el ADN en procesos evolutivos

Uno de los hechos que se puede estudiar en el locus IGH del pez espinoso son los cambios que han ocurrido a nivel de DNA genómico en cortos períodos de tiempo evolutivo. El hecho de que el locus esté triplicado recientemente nos permite comparar los cambios que han ocurrido en las secuencias. En la figura (cliquear en ella para verla bien) se exponen las secuencias de la las zonas que estan las IgM (no he mirado si son zonas exónicas o intrónicas). Se pueden ver mutaciones puntuales que conllevan cambios de nucleótidos y además la presencia de inserciones y delecciones. La inserción en realidad son un alargamiento de una secuencia microsatélite. He visto que esto se utiliza para determinar el tiempo evolutivo y quizás nos pueda ser útil en este caso. Existe un mayor número naciones en la secuencian llamada M1 lo que indicaría una mayor distancia evolutiva de ésta respecto a las otras dos entre sí. Así lo primero debió ser una duplicación que dio esta secuencia (la M1) y posteriormente existió otra que dio a las denominadas M y M2. Pero esto sólo los datos de un trozo de secuencia. Si estas secuencias de duplicaciones fueran ciertas se habría de repetir en otras partes del segmento y permitirían reconstruir el proceso evolutivo.  Quizás este estudio merezca la pena realizarse en detalle.

Tiempo evolutivo para generar genes VH

De los resultados obtenidos del estudio de los genes VH en el pez espinoso se puede concluir que ha existido una diversificación muy reciente a partir de tres genes VH. Además esta diversificación es posterior a la duplicación de los segmentos de las cadenas constantes. A esta conclusión se llega debido a que la homología entre los diferentes genes VH de cada familia es superior al 95% y que la disposición de estos no se corresponden con una duplicación simple de VH preexistente. Los dotplot también indican que con la duplicación de los genes de las regiones constantes solamente se arrastraron tres genes VH a partir de los cuales posteriormente se generaron los demas.
Si determinamos hace cuánto tiempo ocurrió la duplicación de los genes de la región constante podremos saber el tiempo que se tardó en pasar de tres genes VH a 40 genes VH. La cuestión es que no existen diferencias en las secuencias de aminoácidos en los genes de las cadenas constantes indicando que el proceso de duplicación debió ocurrir hace menos de un millón de años. No se puede hacer una determinación exacta debido a que en no existen estudios de calibración del tiempo de evolución de las proteínas de peces. Quizá se pueda intentar con algún otro método como la velocidad de crecimiento de regiones microsatélites. También se evidencia que un homología del 99% en los nucleótidos de los intrones, lo cual nos indica de nuevo el proceso duplicación es menor de un millón de años.
De esto se saca una conclusión interesante (y trascendente). En muy poco tiempo evolutivo se ha generado un repertorio VH. Debe de existir un mecanismo biológico que favorezca la duplicación y expansión de los genes VH. Este mecanismo ha de ser específico de esta región ya que los dominios de la región CH no son afectados por este proceso. Pensar que existen procesos biológicos dirigidos a influenciar el proceso evolutivo de la especie es una cosa muy seria que hay que meditar.

Evolución rápida

Observando detenidamente el locus IGH del pez espinoso existen datos para concluir que han existido cambios groseros muy recientemente. Primero el hecho de presentar por tres veces cada clase de anticuerpo (la IgT cuatro). Cada una de estas clases de anticuerpo tienen una secuencia de aminoácidos idéntica. También he comprobado la composición de los intrones y he encontrado homología superior al 99% en la secuencia de nucleótidos. Un dotplot pone de manifiesto la triplicación reciente de un segmento que lleva regiones VH y todas CH. Adicionalmente hay una cuarta duplicación de regiones VH e IgT.
El hecho de la multiplicación de las regiones constantes está ahí. No hay más problemas, es un hecho claramente descrito y con muchos ejemplos. Estas duplicaciones son el origen la creación de nuevos isotipos y con el paso del tiempo nos darían nuevas clases de anticuerpos. Creo que tiene mucho interés estudiar lo que realmente haya pasado con las regiones VH. Queda claro que han debido duplicarse junto con el segmento que las conlleva, pero además han debido de ocurrir cambios evolutivos específicos de estas regiones. Esto es debido a que son proteínas de interacción con el mundo exterior con una fortísima presión evolutiva. Creo que tenemos una oportunidad única de reconstruir los cambios que han debido ocurrir en las últimas decenas de miles de años en regiones VH en esta especie.
Con estos datos entramos en la discusión de teorías evolutivas. Esto sería un caso contrario al gradualismo de Darwin. Tampoco sería un caso de saltacionismo. Esto cuadraría más con la teoría "punctuated equilibrium" ampliamente criticada. Según esa teoría la evolución ocurriría en poblaciones aisladas geográficamente. La población que no se encuentre aislada, cualquier tipo de cambio genético queda disuelto por cruces en la población general. Aquellas poblaciones en los extremos de los ecosistemas y aisladas geográficamente sufrirán cambios genéticos que condicionarán una especiación rápida. En el pez espinoso hay datos que indican una tendencia en este sentido. Hay trabajos que indican que los peces que viven en la superficie no se cruzan con los peces que viven en el fondo. También nos apoyaría la idea de que es un pez que ha colonizado recientemente en agua dulce y que adicionalmente se acompañado de cambios morfológicos.

Región V en el pez espinoso

En mi primera entrada en el blog me gustaría presentaros a nuestro nuevo modelo experimental: Gasterosteus aculeatus o pez espinoso. Mide de tres a diez centímetros de largo y lo más interesante de este animal es que si bien su origen está en el océano, comenzaron a poblar el agua dulce después de la última edad de hielo. En este proceso de colonización de nuevos hábitats, este pez óseo ha perdido su armadura, es decir, las placas laterales que poseía en el medio marino. Se estima que este proceso ha ocurrido a lo largo de los últimos 20.000 años, un suspiro evolutivamente hablando, donde las unidades son MYA (million years ago).

¿Es posible que también haya habido una adaptación de su sistema inmune al nuevo nicho ecológico?. Para ello Paco (Francisco Gambón) ha comenzado el análisis bioinformático del loci genético de las inmunoglobulinas para su posterior comparación con otros peces de su mismo grupo y los resultados son muy interesantes, como se puede leer en entradas anteriores, y sigue avanzando aunque no adelantaré nada y esperaré acontecimientos.

Yo por mi lado comienzo con el estudio de la región variable. He utilizado los scaffolds públicos subidos a la red por los grupos que secuencian el genoma completo del animal y he comenzado a identificar segmentos V, para ello me he atrevido a mejorar el método de Paco, me explico, todas las VHs se caracterizan por tener en su extremo 3' los aminoácidos YYC (tirosina, tirosina y cisteína) seguidos de otros 3 que varían, por tanto haciendo una primera búsqueda en www. softberry.com en FGENESH de posibles genes en la base de peces, he identificando mediante el NCBI BLASTp nuestra primera VH y a continuación podemos copiar los tres tripletes que codifican para estos 3 aminoácidos y luego buscar este mismo motif permitiendo 2 missmatches ya que el código es degenerado (Tabla).

Primero lo hice de este modo y ayudándome de una secuencia de nucleótidos downstream que, aunque suene un poco raro, es "CACA" y marca el comienzo de la RSS (recombiantion signal sequence), y por el extremo 5' utilizando la regla de que un "AG" es un splicing aceptor y señal de comienzo (hay que recordar que las VHs no cumplen el "GT" como splicing donor), identifiqué 38 segmentos de Vs, pero entonces se me ocurrió comprobar las posibles combinaciones que produce la degeneración del código para codificar "YYC" y me salieron 8 posibilidades:

Con lo cual comprobé que permitieno solo 2 missmatches podía perder algún segmento y repetí la búsqueda pero ahora buscando las 8 posibilidades por separado y BINGO, encontré 2 nuevas VHs, en total 40. Otra opción sería aumentar los missmatches pero se degeneraría tanto el motif que no sería fiable para identificarlas.

Alineé las 40 VHs en el programa MEGA y el alineamiento es muy robusto, curiosamente el 6º aminoácido de todas las secuencias es el único que se conserva en todas y es siempre una Leucina ("L"). Filogenéticamente los primeros árboles que he realizado separan claramente dos grandes grupos aunque tendré que esudiarlo mas a fondo y leer bibliografía para su correcta clasificación por familias, por ejemplo en el Protopterus aethiopicus (Dipnoi) se encontraron 8 familias diferenciadas.

Ahora faltaría también buscar VHs en dirección 3'-5' y de aparecer alguna, adjuntarlas al alineamiento así como identificar los segmentos D y J.

Mañana más y mejor. Un saludo a tod@s.

La IgZ y la IgT

Existe confusión con la IgZ y la IgT. Las dos se dieron a conocer a la vez en revistas diferentes. Un grupo describió la IgZ en Zebra fish (D. rerio) y otro grupo describió la IgT en la trucha arco iris (O. mykiss). Ambos anticuerpos están constituidos por cuatro dominios inmunoglobulinas y además tienen formas de membrana y secretada. He hecho el estudio del árbol filogenético, dominio a dominio y se puede concluir claramente de que ambos anticuerpos son la misma clase de inmunoglobulina. Las diferencias entre la IgT y la IgZ son las mismas que entre la IgG humana y la IgG de caballo. El anticuerpo que nosotros hemos encontrado en el pez espinoso se parece más a la IgT, pero esto es simplemente por que es un pez que se encuentra más próximo evolutivamente a la trucha que al pez zebra. Otro dato que también se puede concluir con claridad es que estas inmunoglobulinas son un proceso de duplicación de la IgM y debió ocurrir muy temprano en el momento de la divergencia de los peces teleósteos. Otro dato de interés se encuentra en la poca variación que existe en el dominio CH1. De nuevo la explicación más congruente es la ya expresada por nosotros los en anteriores artículos de que existe una tendencia a intercambiarse el primer exon de los anticuerpos entre sí.
Existen otros los anticuerpos publicados, uno de los cuales he introducido en el estudio (anticuerpo de la siniperca) que claramente pertenece a este grupo de la IgT. El otro anticuerpo del takifugu sólo tiene dos dominios inmunoglobulinas y tengo que realizar todavía el estudio.

Un anticuerpo nuevo en el pez espinoso

El locus IGH del pez espinoso está triplicado. Existen tres IgM y tres IgD. Además en el lado 5' de la IgM hay un anticuerpo que hay que estudiar en detalle. La homología más próxima a este anticuerpo es la IgZ ( otros la llaman IgT). Pero no es exactamente esta clase de anticuerpo ya que la IgZ/T tiene cuatro dominios de inmunoglobulina y este sólo tiene tres. Parece que este anticuerpo del pez espinoso es origen de un proceso de recombinación entre la IgM y la IgZ/T ( En la literatura he encontrado que existe otro caso similar descrito). la IgM dio el CH1 y la IgZ/T dio los otros dos dominios. De este anticuerpo existen cuatro isotipos en el genoma, uno de ellos puede que sea un pseudogene.

Los dominios que conformaron la IgD y la IgY de los animales que pasaron a tierra tienen que estar en los peces. El pez espinoso es un teleósteo, un grupo muy numeroso y que conforma la mayoría de los peces. Estos peces se expandieron a principios del Triásico coincidiendo con la salida a tierra de una familia generada posteriormente a la cual pertenece el pez pulmonado. Un estudio detallado de las secuencias de aminoácidos de los dominios inmunoglobulina de los anticuerpos de los peces tiene que ser suficiente para esclarecer el origen de la IgY y la IgD de reptil (este último caso es importante ya que de ésta deriva la IgD de los mamíferos).

El locus IGH en el pez espinoso

Comienzo con el estudio de locus genéticos completos descritos en peces. De momento he encontrado que el único locus IgH completo publicado es el Zebra Fish. He comprobado que hay bastantes peces en proceso de secuenciación de su genoma. Me he fijado en el Gasterosteus aculeatus (pez espinoso). Sorprende el gran número de isotipos que parece que van a existir. La imagen de arriba muestra un segmento de 80Kb, pero parece que se continúa por ambos extremos y además debe haber más segmentos en otro cromosoma.

¿De dónde viene la IgD de los reptiles?. En anfibios hay poco publicado solamente está descrita la IgD de Xenopus tropicalis. Esta IgD tiene una relación con la IgD de los reptiles, pero no aclara mucho. Solamente los cuatro primeros dominios parecen que tienen cierta ortología con los cuatro primeros dominios de la IgD de los reptiles. El resto de los dominios de la IgD de Xenopus son duplicados de los primeros. Por lo tanto para buscar el origen de los dominios de inmunoglobulina del los reptiles hay que estudiar anticuerpos equivalentes en peces.

Casi todo está dicho en marsupiales

Hay mucho publicado sobre los anticuerpos de los marsupiales. Sobre todo en el colicorto. Al revisar su locus IGH no aparece ninguna sorpresa. Los mismos anticuerpos que habían sido descritos mediante estudios hechos sobre RNA mensajero son los que aparecen en el DNA genómico. También como referí en la anterior entrada se encuentra un gran número de trasposomas. Este hecho he comprobado que está ya publicado en el artículo principal del genoma del marsupial. En los marsupiales ha habido una amplia replicación de trasposomas que parecen específicos de esta línea evolutiva. Igualmente se concluye que estos trasposomas son causantes probables de destrucción de genes. Por lo tanto lo más prudente es dejar de momento este estudio aquí. Sólo quedaría el intentar discernir cómo estos trasposomas eliminaron la IgY y la IgD. Esta tarea me parece complicada de momento, y no existe la certeza de que haya datos suficientes para hacer el estudio. La presencia de dos pseudogenes de la IgM podría ayudar.
Habrá que esperar a la secuencia de un segundo marsupial. En estos momentos se está secuenciando el Wallaby ( canguro pequeño). El genoma que está a disposición pública en la actualidad solo he podido encontrar la IgM. Una comparación de locus IGH de ambos genomas puede que reactive el estudio.

Pérdida de la IgD por retrotrasposomas en Marsupiales.

Monodelphis domestica
En el segmento de DNA genómico que se encuentra entre la IgM y la IgG he detectado 20 secuencias viricas intactas. Todas ellas tienen su codon de inicio (ATG) y su cordón de terminación. la trama de lectura es larga a veces de 300 aminoácidos y las proteínas codificadas se corresponden con transcriptasa reversas y trasposinasas. estas 20 secuencias se pueden clasificar en cuatro grupos (uno es tipo LINE-1, y los otros pertenecen a la familia RT-like).
Por lo que he leído hasta el 50% del genoma de los mamíferos está constituido por estas secuencias. Por lo tanto el encontrarlas no debería ser nada extraño, pero el hecho de encontrarse en esta zona en alta densidad y no encontrarse en el ornitorrinco hace suponer que estos trasposomas fueron los responsables de la pérdida evolutiva del gen IGHY y IGHD en los marsupiales. Más aún, he podido determinar que además de las secuencias intactas del virus, existen estas mismas secuencias repetidas, pero con codones stop.
Con estos resultados se puede hacer una recapitulación de lo que debió de ocurrir. En un genoma similar al del ornitorrinco se insertó un o varios trasposomas en la zona de la IgD y la IgY. Esta inserción debió anular estos genes que por la deriva mutacional debieron ser borrados del genoma. Mientras tanto los trasposomas debieron seguir reproduciéndose de forma muy lenta generando más secuencias, la mayoría de ellas por el devenir mutacional empezaron a ser borradas, pero otras continuaron reproduciéndose. Así podemos explicar la presencia de genes viables intactos viricos junto con genes mutados y en fase de borrado.
Es interesante el hecho de que los trasposomas se comportan como parásitos. No pueden reproducirse muy rápido porque matarían al huésped, ni muy lentos, porque si no por la mutación serían borrados. De esta forma el huésped puede sobrevivir y de vez en cuando los trasposomas le producen alteraciones genéticas importantes que deben de tener importancia desde un punto de vista evolutivo.
No se puede hacer un experimento evolutivo para poder demostrar lo anterior, pero si estas secuencias se encuentran en otros marsupiales ayudarían a mantener esta hipótesis. He visto que se está secuenciando el genoma completo de un canguro (Wallaby). Sí es cierto lo que he comentado arriba aparecerá algo similar en estos animales. Me voy a poner a buscarlo.

Secuencias de retrotrasposomas en vez de IgD en el colicorto

He encontrado el locus IGH de Monodelphis doméstica (marsupial). En él aparecen todos los anticuerpos clásicos de los mamíferos, ya estudiados en este animal a nivel de RNA mensajero. No aparece la IgD ni la IgY que hemos encontrado en el ornitorrinco. Otro dato de interés es la presencia en el genoma de tres IgM. Dos de ellas se encuentran en el cromosoma uno y la otra que puede ser un pseudogen está en un segmento no asignado cromosoma todavía.
Parece que el estudio de este locus no nos va a dar nada de interés. Pensando más detenidamente puede que nos diga algo. Los marsupiales divergieron del resto de los mamíferos poco después de que lo hicieran los monotremas. Por lo tanto es sorprendente la desaparición tan abrupta de dos genes que han sido muy importantes en evolución hasta esos momentos. La zona que hay entre la IgM y la IgG es muy extensa. En esta zona es fácil comprobar la existencia de un gran número de secuencias víricas repetidas. Éstas secuencias configuran genes únicos con un solo exon y sorprendentemente no existen codones stop en la secuencia. Estadísticamente es imposible que una secuencia de unas 1000 pares de bases no se genere un codon stop a no ser que haya una selección positiva que mantenga la trama de lectura. Además estas secuencias viricas parece que están colocadas de forma alternativa en una y otra dirección del DNA generando enormes palindromes. También es de destacar la gran similitud en secuencia entre ellas.
Será necesario gastar algo de tiempo en este locus ya que las secuencias víricas también las hemos observado en los genes de Eublepharis macularius, sobre todo en los genes generados por procesos de recombinación.

Buscando en nuevas especies

Llevo buscando muchas horas los genes de los anticuerpos en los genomas de las aves.
El genoma del pollo es el que está más completo. Sus anticuerpos están secuenciados de RNAs mensajeros. Parece fácil localizarlos en el genoma, pero tras exhaustivas búsquedas no he encontrado los genes. Cansado del pollo me he ido al Zebra finch (no sé cómo es en castellano), pero me ocurrió lo mismo, he sido incapaz que localizar los genes de los anticuerpos. Si que he encontrado un trozo de IgA en un ETS (quizás haya que volver a él en el futuro). Es un tema que creo que hay que dejar hasta que aparezca una nueva versión de estos genomas.
También encontré que se están secuenciando los genomas del pavo y la codorniz por los veterinarios. La cuestón es que sus genomas no están muy accesibles.
Por lo tanto el único locus genético completamente secuenciado de aves es el del pato. Nos quedamos con la duda de si todas las aves van a tener las mismas clases de anticuerpos.
Mirando en la base de datos del GENBANK he encontrado que han introducido la secuencia del RNA mensajero de la IgD del ornitorrinco y que la han sometido a publicación. Creo que los autores son los mismos chinos que introdujeron en GENBANK las secuencias de los anticuerpos de Anolis carolinensis. Al final parece que su artículo (el que escribieron el verano pasado) no debió ser publicado o va a ser publicado junto con el nuestro. Da la sensación de que la publicación de la IgD del ornitorrinco puede que la lleven a cabo ya que el artículo lo firman con K. Belov, aunque va de penúltimo nombre. Los autores no tienen practicamente ninguna publicación, por lo tanto si nos damos un poco de prisa no creo que sea problemático para nuestra publicación.
Por casualidad he mirado el genoma del armadillo. He encontrado los tres últimos dominios de la IgM que me han valido para hacer un árbol filogenético. He visto que este animal tiene un tiempo de divergencia del resto de los mamíferos parecido al de los marsupiales. Por lo tanto el locus puede ser interesante estudiarlo. En principio los marsupiales no tienen IgD con lo cual no aporta ninguna información adicional. Sería interesante buscar un mamífero que tuviera alguna IgD con una estructura intermedia entre la del ornitorrinco y la de los mamíferos de con pezuña o primates (el armadillo podría ser uno de ellos).