Modificaciones en el ADN en procesos evolutivos

Uno de los hechos que se puede estudiar en el locus IGH del pez espinoso son los cambios que han ocurrido a nivel de DNA genómico en cortos períodos de tiempo evolutivo. El hecho de que el locus esté triplicado recientemente nos permite comparar los cambios que han ocurrido en las secuencias. En la figura (cliquear en ella para verla bien) se exponen las secuencias de la las zonas que estan las IgM (no he mirado si son zonas exónicas o intrónicas). Se pueden ver mutaciones puntuales que conllevan cambios de nucleótidos y además la presencia de inserciones y delecciones. La inserción en realidad son un alargamiento de una secuencia microsatélite. He visto que esto se utiliza para determinar el tiempo evolutivo y quizás nos pueda ser útil en este caso. Existe un mayor número naciones en la secuencian llamada M1 lo que indicaría una mayor distancia evolutiva de ésta respecto a las otras dos entre sí. Así lo primero debió ser una duplicación que dio esta secuencia (la M1) y posteriormente existió otra que dio a las denominadas M y M2. Pero esto sólo los datos de un trozo de secuencia. Si estas secuencias de duplicaciones fueran ciertas se habría de repetir en otras partes del segmento y permitirían reconstruir el proceso evolutivo.  Quizás este estudio merezca la pena realizarse en detalle.

Tiempo evolutivo para generar genes VH

De los resultados obtenidos del estudio de los genes VH en el pez espinoso se puede concluir que ha existido una diversificación muy reciente a partir de tres genes VH. Además esta diversificación es posterior a la duplicación de los segmentos de las cadenas constantes. A esta conclusión se llega debido a que la homología entre los diferentes genes VH de cada familia es superior al 95% y que la disposición de estos no se corresponden con una duplicación simple de VH preexistente. Los dotplot también indican que con la duplicación de los genes de las regiones constantes solamente se arrastraron tres genes VH a partir de los cuales posteriormente se generaron los demas.
Si determinamos hace cuánto tiempo ocurrió la duplicación de los genes de la región constante podremos saber el tiempo que se tardó en pasar de tres genes VH a 40 genes VH. La cuestión es que no existen diferencias en las secuencias de aminoácidos en los genes de las cadenas constantes indicando que el proceso de duplicación debió ocurrir hace menos de un millón de años. No se puede hacer una determinación exacta debido a que en no existen estudios de calibración del tiempo de evolución de las proteínas de peces. Quizá se pueda intentar con algún otro método como la velocidad de crecimiento de regiones microsatélites. También se evidencia que un homología del 99% en los nucleótidos de los intrones, lo cual nos indica de nuevo el proceso duplicación es menor de un millón de años.
De esto se saca una conclusión interesante (y trascendente). En muy poco tiempo evolutivo se ha generado un repertorio VH. Debe de existir un mecanismo biológico que favorezca la duplicación y expansión de los genes VH. Este mecanismo ha de ser específico de esta región ya que los dominios de la región CH no son afectados por este proceso. Pensar que existen procesos biológicos dirigidos a influenciar el proceso evolutivo de la especie es una cosa muy seria que hay que meditar.

Evolución rápida

Observando detenidamente el locus IGH del pez espinoso existen datos para concluir que han existido cambios groseros muy recientemente. Primero el hecho de presentar por tres veces cada clase de anticuerpo (la IgT cuatro). Cada una de estas clases de anticuerpo tienen una secuencia de aminoácidos idéntica. También he comprobado la composición de los intrones y he encontrado homología superior al 99% en la secuencia de nucleótidos. Un dotplot pone de manifiesto la triplicación reciente de un segmento que lleva regiones VH y todas CH. Adicionalmente hay una cuarta duplicación de regiones VH e IgT.
El hecho de la multiplicación de las regiones constantes está ahí. No hay más problemas, es un hecho claramente descrito y con muchos ejemplos. Estas duplicaciones son el origen la creación de nuevos isotipos y con el paso del tiempo nos darían nuevas clases de anticuerpos. Creo que tiene mucho interés estudiar lo que realmente haya pasado con las regiones VH. Queda claro que han debido duplicarse junto con el segmento que las conlleva, pero además han debido de ocurrir cambios evolutivos específicos de estas regiones. Esto es debido a que son proteínas de interacción con el mundo exterior con una fortísima presión evolutiva. Creo que tenemos una oportunidad única de reconstruir los cambios que han debido ocurrir en las últimas decenas de miles de años en regiones VH en esta especie.
Con estos datos entramos en la discusión de teorías evolutivas. Esto sería un caso contrario al gradualismo de Darwin. Tampoco sería un caso de saltacionismo. Esto cuadraría más con la teoría "punctuated equilibrium" ampliamente criticada. Según esa teoría la evolución ocurriría en poblaciones aisladas geográficamente. La población que no se encuentre aislada, cualquier tipo de cambio genético queda disuelto por cruces en la población general. Aquellas poblaciones en los extremos de los ecosistemas y aisladas geográficamente sufrirán cambios genéticos que condicionarán una especiación rápida. En el pez espinoso hay datos que indican una tendencia en este sentido. Hay trabajos que indican que los peces que viven en la superficie no se cruzan con los peces que viven en el fondo. También nos apoyaría la idea de que es un pez que ha colonizado recientemente en agua dulce y que adicionalmente se acompañado de cambios morfológicos.

Región V en el pez espinoso

En mi primera entrada en el blog me gustaría presentaros a nuestro nuevo modelo experimental: Gasterosteus aculeatus o pez espinoso. Mide de tres a diez centímetros de largo y lo más interesante de este animal es que si bien su origen está en el océano, comenzaron a poblar el agua dulce después de la última edad de hielo. En este proceso de colonización de nuevos hábitats, este pez óseo ha perdido su armadura, es decir, las placas laterales que poseía en el medio marino. Se estima que este proceso ha ocurrido a lo largo de los últimos 20.000 años, un suspiro evolutivamente hablando, donde las unidades son MYA (million years ago).

¿Es posible que también haya habido una adaptación de su sistema inmune al nuevo nicho ecológico?. Para ello Paco (Francisco Gambón) ha comenzado el análisis bioinformático del loci genético de las inmunoglobulinas para su posterior comparación con otros peces de su mismo grupo y los resultados son muy interesantes, como se puede leer en entradas anteriores, y sigue avanzando aunque no adelantaré nada y esperaré acontecimientos.

Yo por mi lado comienzo con el estudio de la región variable. He utilizado los scaffolds públicos subidos a la red por los grupos que secuencian el genoma completo del animal y he comenzado a identificar segmentos V, para ello me he atrevido a mejorar el método de Paco, me explico, todas las VHs se caracterizan por tener en su extremo 3' los aminoácidos YYC (tirosina, tirosina y cisteína) seguidos de otros 3 que varían, por tanto haciendo una primera búsqueda en www. softberry.com en FGENESH de posibles genes en la base de peces, he identificando mediante el NCBI BLASTp nuestra primera VH y a continuación podemos copiar los tres tripletes que codifican para estos 3 aminoácidos y luego buscar este mismo motif permitiendo 2 missmatches ya que el código es degenerado (Tabla).

Primero lo hice de este modo y ayudándome de una secuencia de nucleótidos downstream que, aunque suene un poco raro, es "CACA" y marca el comienzo de la RSS (recombiantion signal sequence), y por el extremo 5' utilizando la regla de que un "AG" es un splicing aceptor y señal de comienzo (hay que recordar que las VHs no cumplen el "GT" como splicing donor), identifiqué 38 segmentos de Vs, pero entonces se me ocurrió comprobar las posibles combinaciones que produce la degeneración del código para codificar "YYC" y me salieron 8 posibilidades:

Con lo cual comprobé que permitieno solo 2 missmatches podía perder algún segmento y repetí la búsqueda pero ahora buscando las 8 posibilidades por separado y BINGO, encontré 2 nuevas VHs, en total 40. Otra opción sería aumentar los missmatches pero se degeneraría tanto el motif que no sería fiable para identificarlas.

Alineé las 40 VHs en el programa MEGA y el alineamiento es muy robusto, curiosamente el 6º aminoácido de todas las secuencias es el único que se conserva en todas y es siempre una Leucina ("L"). Filogenéticamente los primeros árboles que he realizado separan claramente dos grandes grupos aunque tendré que esudiarlo mas a fondo y leer bibliografía para su correcta clasificación por familias, por ejemplo en el Protopterus aethiopicus (Dipnoi) se encontraron 8 familias diferenciadas.

Ahora faltaría también buscar VHs en dirección 3'-5' y de aparecer alguna, adjuntarlas al alineamiento así como identificar los segmentos D y J.

Mañana más y mejor. Un saludo a tod@s.

La IgZ y la IgT

Existe confusión con la IgZ y la IgT. Las dos se dieron a conocer a la vez en revistas diferentes. Un grupo describió la IgZ en Zebra fish (D. rerio) y otro grupo describió la IgT en la trucha arco iris (O. mykiss). Ambos anticuerpos están constituidos por cuatro dominios inmunoglobulinas y además tienen formas de membrana y secretada. He hecho el estudio del árbol filogenético, dominio a dominio y se puede concluir claramente de que ambos anticuerpos son la misma clase de inmunoglobulina. Las diferencias entre la IgT y la IgZ son las mismas que entre la IgG humana y la IgG de caballo. El anticuerpo que nosotros hemos encontrado en el pez espinoso se parece más a la IgT, pero esto es simplemente por que es un pez que se encuentra más próximo evolutivamente a la trucha que al pez zebra. Otro dato que también se puede concluir con claridad es que estas inmunoglobulinas son un proceso de duplicación de la IgM y debió ocurrir muy temprano en el momento de la divergencia de los peces teleósteos. Otro dato de interés se encuentra en la poca variación que existe en el dominio CH1. De nuevo la explicación más congruente es la ya expresada por nosotros los en anteriores artículos de que existe una tendencia a intercambiarse el primer exon de los anticuerpos entre sí.
Existen otros los anticuerpos publicados, uno de los cuales he introducido en el estudio (anticuerpo de la siniperca) que claramente pertenece a este grupo de la IgT. El otro anticuerpo del takifugu sólo tiene dos dominios inmunoglobulinas y tengo que realizar todavía el estudio.

Un anticuerpo nuevo en el pez espinoso

El locus IGH del pez espinoso está triplicado. Existen tres IgM y tres IgD. Además en el lado 5' de la IgM hay un anticuerpo que hay que estudiar en detalle. La homología más próxima a este anticuerpo es la IgZ ( otros la llaman IgT). Pero no es exactamente esta clase de anticuerpo ya que la IgZ/T tiene cuatro dominios de inmunoglobulina y este sólo tiene tres. Parece que este anticuerpo del pez espinoso es origen de un proceso de recombinación entre la IgM y la IgZ/T ( En la literatura he encontrado que existe otro caso similar descrito). la IgM dio el CH1 y la IgZ/T dio los otros dos dominios. De este anticuerpo existen cuatro isotipos en el genoma, uno de ellos puede que sea un pseudogene.

Los dominios que conformaron la IgD y la IgY de los animales que pasaron a tierra tienen que estar en los peces. El pez espinoso es un teleósteo, un grupo muy numeroso y que conforma la mayoría de los peces. Estos peces se expandieron a principios del Triásico coincidiendo con la salida a tierra de una familia generada posteriormente a la cual pertenece el pez pulmonado. Un estudio detallado de las secuencias de aminoácidos de los dominios inmunoglobulina de los anticuerpos de los peces tiene que ser suficiente para esclarecer el origen de la IgY y la IgD de reptil (este último caso es importante ya que de ésta deriva la IgD de los mamíferos).

El locus IGH en el pez espinoso

Comienzo con el estudio de locus genéticos completos descritos en peces. De momento he encontrado que el único locus IgH completo publicado es el Zebra Fish. He comprobado que hay bastantes peces en proceso de secuenciación de su genoma. Me he fijado en el Gasterosteus aculeatus (pez espinoso). Sorprende el gran número de isotipos que parece que van a existir. La imagen de arriba muestra un segmento de 80Kb, pero parece que se continúa por ambos extremos y además debe haber más segmentos en otro cromosoma.

¿De dónde viene la IgD de los reptiles?. En anfibios hay poco publicado solamente está descrita la IgD de Xenopus tropicalis. Esta IgD tiene una relación con la IgD de los reptiles, pero no aclara mucho. Solamente los cuatro primeros dominios parecen que tienen cierta ortología con los cuatro primeros dominios de la IgD de los reptiles. El resto de los dominios de la IgD de Xenopus son duplicados de los primeros. Por lo tanto para buscar el origen de los dominios de inmunoglobulina del los reptiles hay que estudiar anticuerpos equivalentes en peces.

Casi todo está dicho en marsupiales

Hay mucho publicado sobre los anticuerpos de los marsupiales. Sobre todo en el colicorto. Al revisar su locus IGH no aparece ninguna sorpresa. Los mismos anticuerpos que habían sido descritos mediante estudios hechos sobre RNA mensajero son los que aparecen en el DNA genómico. También como referí en la anterior entrada se encuentra un gran número de trasposomas. Este hecho he comprobado que está ya publicado en el artículo principal del genoma del marsupial. En los marsupiales ha habido una amplia replicación de trasposomas que parecen específicos de esta línea evolutiva. Igualmente se concluye que estos trasposomas son causantes probables de destrucción de genes. Por lo tanto lo más prudente es dejar de momento este estudio aquí. Sólo quedaría el intentar discernir cómo estos trasposomas eliminaron la IgY y la IgD. Esta tarea me parece complicada de momento, y no existe la certeza de que haya datos suficientes para hacer el estudio. La presencia de dos pseudogenes de la IgM podría ayudar.
Habrá que esperar a la secuencia de un segundo marsupial. En estos momentos se está secuenciando el Wallaby ( canguro pequeño). El genoma que está a disposición pública en la actualidad solo he podido encontrar la IgM. Una comparación de locus IGH de ambos genomas puede que reactive el estudio.

Pérdida de la IgD por retrotrasposomas en Marsupiales.

Monodelphis domestica
En el segmento de DNA genómico que se encuentra entre la IgM y la IgG he detectado 20 secuencias viricas intactas. Todas ellas tienen su codon de inicio (ATG) y su cordón de terminación. la trama de lectura es larga a veces de 300 aminoácidos y las proteínas codificadas se corresponden con transcriptasa reversas y trasposinasas. estas 20 secuencias se pueden clasificar en cuatro grupos (uno es tipo LINE-1, y los otros pertenecen a la familia RT-like).
Por lo que he leído hasta el 50% del genoma de los mamíferos está constituido por estas secuencias. Por lo tanto el encontrarlas no debería ser nada extraño, pero el hecho de encontrarse en esta zona en alta densidad y no encontrarse en el ornitorrinco hace suponer que estos trasposomas fueron los responsables de la pérdida evolutiva del gen IGHY y IGHD en los marsupiales. Más aún, he podido determinar que además de las secuencias intactas del virus, existen estas mismas secuencias repetidas, pero con codones stop.
Con estos resultados se puede hacer una recapitulación de lo que debió de ocurrir. En un genoma similar al del ornitorrinco se insertó un o varios trasposomas en la zona de la IgD y la IgY. Esta inserción debió anular estos genes que por la deriva mutacional debieron ser borrados del genoma. Mientras tanto los trasposomas debieron seguir reproduciéndose de forma muy lenta generando más secuencias, la mayoría de ellas por el devenir mutacional empezaron a ser borradas, pero otras continuaron reproduciéndose. Así podemos explicar la presencia de genes viables intactos viricos junto con genes mutados y en fase de borrado.
Es interesante el hecho de que los trasposomas se comportan como parásitos. No pueden reproducirse muy rápido porque matarían al huésped, ni muy lentos, porque si no por la mutación serían borrados. De esta forma el huésped puede sobrevivir y de vez en cuando los trasposomas le producen alteraciones genéticas importantes que deben de tener importancia desde un punto de vista evolutivo.
No se puede hacer un experimento evolutivo para poder demostrar lo anterior, pero si estas secuencias se encuentran en otros marsupiales ayudarían a mantener esta hipótesis. He visto que se está secuenciando el genoma completo de un canguro (Wallaby). Sí es cierto lo que he comentado arriba aparecerá algo similar en estos animales. Me voy a poner a buscarlo.

Secuencias de retrotrasposomas en vez de IgD en el colicorto

He encontrado el locus IGH de Monodelphis doméstica (marsupial). En él aparecen todos los anticuerpos clásicos de los mamíferos, ya estudiados en este animal a nivel de RNA mensajero. No aparece la IgD ni la IgY que hemos encontrado en el ornitorrinco. Otro dato de interés es la presencia en el genoma de tres IgM. Dos de ellas se encuentran en el cromosoma uno y la otra que puede ser un pseudogen está en un segmento no asignado cromosoma todavía.
Parece que el estudio de este locus no nos va a dar nada de interés. Pensando más detenidamente puede que nos diga algo. Los marsupiales divergieron del resto de los mamíferos poco después de que lo hicieran los monotremas. Por lo tanto es sorprendente la desaparición tan abrupta de dos genes que han sido muy importantes en evolución hasta esos momentos. La zona que hay entre la IgM y la IgG es muy extensa. En esta zona es fácil comprobar la existencia de un gran número de secuencias víricas repetidas. Éstas secuencias configuran genes únicos con un solo exon y sorprendentemente no existen codones stop en la secuencia. Estadísticamente es imposible que una secuencia de unas 1000 pares de bases no se genere un codon stop a no ser que haya una selección positiva que mantenga la trama de lectura. Además estas secuencias viricas parece que están colocadas de forma alternativa en una y otra dirección del DNA generando enormes palindromes. También es de destacar la gran similitud en secuencia entre ellas.
Será necesario gastar algo de tiempo en este locus ya que las secuencias víricas también las hemos observado en los genes de Eublepharis macularius, sobre todo en los genes generados por procesos de recombinación.

Buscando en nuevas especies

Llevo buscando muchas horas los genes de los anticuerpos en los genomas de las aves.
El genoma del pollo es el que está más completo. Sus anticuerpos están secuenciados de RNAs mensajeros. Parece fácil localizarlos en el genoma, pero tras exhaustivas búsquedas no he encontrado los genes. Cansado del pollo me he ido al Zebra finch (no sé cómo es en castellano), pero me ocurrió lo mismo, he sido incapaz que localizar los genes de los anticuerpos. Si que he encontrado un trozo de IgA en un ETS (quizás haya que volver a él en el futuro). Es un tema que creo que hay que dejar hasta que aparezca una nueva versión de estos genomas.
También encontré que se están secuenciando los genomas del pavo y la codorniz por los veterinarios. La cuestón es que sus genomas no están muy accesibles.
Por lo tanto el único locus genético completamente secuenciado de aves es el del pato. Nos quedamos con la duda de si todas las aves van a tener las mismas clases de anticuerpos.
Mirando en la base de datos del GENBANK he encontrado que han introducido la secuencia del RNA mensajero de la IgD del ornitorrinco y que la han sometido a publicación. Creo que los autores son los mismos chinos que introdujeron en GENBANK las secuencias de los anticuerpos de Anolis carolinensis. Al final parece que su artículo (el que escribieron el verano pasado) no debió ser publicado o va a ser publicado junto con el nuestro. Da la sensación de que la publicación de la IgD del ornitorrinco puede que la lleven a cabo ya que el artículo lo firman con K. Belov, aunque va de penúltimo nombre. Los autores no tienen practicamente ninguna publicación, por lo tanto si nos damos un poco de prisa no creo que sea problemático para nuestra publicación.
Por casualidad he mirado el genoma del armadillo. He encontrado los tres últimos dominios de la IgM que me han valido para hacer un árbol filogenético. He visto que este animal tiene un tiempo de divergencia del resto de los mamíferos parecido al de los marsupiales. Por lo tanto el locus puede ser interesante estudiarlo. En principio los marsupiales no tienen IgD con lo cual no aporta ninguna información adicional. Sería interesante buscar un mamífero que tuviera alguna IgD con una estructura intermedia entre la del ornitorrinco y la de los mamíferos de con pezuña o primates (el armadillo podría ser uno de ellos).