El penúltimo artículo y primera incursión en peces

Siguiendo con la puesta al día del blog, presentamos el penúltimo artículo (el último está en el horno) y primero en peces. Allá por Marzo de este año, empezábamos a esbozar las primeras ideas en torno al locus genético de las inmunoglobulinas del pez espinoso, evolución rápida, regiones V y su agrupamiento en familias, nuevos anticuerpos... y finalmente el resultado ha sido la publicación en Developmental and Comparative Immunology en Septiembre de este año con el título de "Presence of an unique IgT on the IGH locus in three-spined stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) and the very recent generation of a repertoire of VH genes". Espero que disfrutéis este sustancioso trabajo donde por ejemplo se concluye que la IgZ del pez zebra y la IgT de la trucha arcoiris y otras formas descritas posteriormente (IgZ/T), como en la Siniperca chuatsi, tienen una clara relación evolutiva y pueden ser agrupados bajo una misma clase de anticuerpos, y también que la rápida generación del repertorio VH puede tener relación con la adaptación de los peces a nuevos hábitats, constituyendo un modelo biológico que aclare los procesos evolutivos que originan los genes de inmunoglobulinas.

En la próxima entrada espero colgar el link del siguiente artículo ;)

Presentación de la charla "Origen evolutivo de los anticuerpos" por el Dr. Gambón Deza

La charla tuvo lugar en el IEO de Vigo en Noviembre de este año y en ella se hace un repaso al origen evolutivo de los anticuerpos, destacándose como conclusión que existe una similitud en la organización del locus genético para las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas (IGH) en reptiles, anfibios y mamíferos, lo que sugiere que la reorganización genómica de este locus fue anterior al origen de los vertebrados tetrápodos.

El trabajo en su origen se planteó desde la necesidad de procesar y obtener el mayor conocimiento posible de los genomas de vertebrados que están siendo publicados (en la actualidad hay 16 genomas introducidos en bases de datos de uso público) y más concretamente, poder dilucidar cómo han evolucionado genes importantes para el funcionamiento del sistema inmune, como los de las inmunoglobulinas.

Se relata que en el inicio del proyecto sólo existían datos relacionados con la estructura del locus IGH en mamíferos, anfibios y algunos peces teleósteos, sin embargo, no existían trabajos que analizasen dicho locus en reptiles, los cuales representan un nexo evolutivo muy importante entre animales acuáticos y mamíferos terrestres.

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El origen evolutivo de la inmunoglobulina A

Hace dos años propusimos que la IgA tiene un origen por recombinación de la IgM y la IgY. Esta idea surgió como consecuencia del estudio de un anticuerpo nuevo encontrado en Eublepharis macularius que claramente era originario por este proceso de recombinación. En un principio cuando no sospechábamos de esta recombinación las búsquedas en el BLAST con su secuencia nos indicaba que era un anticuerpo similar a la IgX de Xenopus. Todo esto desencadenó la hipótesis de que todas las inmunoglobulinas A podrían tener un origen similar. Después de estudiar multitud de anticuerpos seguimos creyendo que el origen de la IgA se produce por este proceso de recombinación. Pero una cuestión que es importante es que las IgAs de cada clade evolutiva (aves, mamíferos y geckos) se ha producido por un proceso de recombinación diferente. Es decir, durante el proceso de evolución ha ocurrido varias veces la recombinación entre la IgM y la IgY, siendo las IgA encontradas en la actualidad descendientes de estos procesos de recombinación. Por lo tanto no existe un único proceso de recombinación que diera todas las IgA.

Cuando publicamos el artículo pensamos que los datos eran de interés. Era necesario esperar un tiempo para comprobar si otros grupos de investigación tomaban esta hipótesis como suficientemente plausible para poder discutirla. Han salido en estos momentos dos artículos del Dr. Zhao en el J. Immunol. En el que presentan trabajos muy similares a los nuestros realizados en Anolis carolinensis y en el ornitorrinco. En los resultados no existen contradicciones con lo publicado por nosotros. Nos agrada que vean plausible que el origen de la IgA sea por origen de recombinación, dándo apoyo a nuestra hipótesis.

Coevolución de los genes de las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos

Quizás uno de los procesos más interesantes de coevolución a nivel genómico sea él de la evolución de las cadenas que componen los anticuerpos. En los peces cartilaginosos los anticuerpos ya tienen cadenas pesadas y cadenas ligeras. Tanto las unas como las otras están constituidas por dominios inmunoglobulina lo que indican un origen común. Por lo tanto los anticuerpos parece que desde un primer momento ya estaban constituidos por ambas cadenas. El hecho que el lugar del unión al antígeno está conformado por las regiones variables de ambas cadenas quizás haya constituido la mayor presión evolutiva para el mantenimiento de una estructura similar.

Pero el sistema tiene incongruencias. En un principio parece que debió haber múltiples cadenas ligeras, tan es así que los peces parece que tienen cuatro tipos de estas cadenas. Posteriormente en los animales que pasaron la tierra hubo una disminución existiendo solamente tres en los anfibios, dos en reptiles y mamíferos y una en aves. El hecho de que existan varias no encontramos una explicación a nivel evolutivo por que no se ha encontrado ninguna diferencia en la funcionalidad de un anticuerpo tenga una cadena variable o tenga otra. Quizás la clave esté en el repertorio de estas cadenas. Así en mamíferos suele ser muy común el uso predominante de las cadenas kappa mientras que en reptiles probablemente se use mas la cadena lambda.

También quedan muchas respuestas sin contestar. ¿Por qué las cadenas kappa únicamente tienen un isotipo?. ¿Por qué las cadenas lambda casi siempre tienen tres isotipos?. En las cadenas Lambda es de interés el mantenimiento de la secuencia de aminoácidos en cada uno de los isotipos de estas. Así que presentan tres isotipos que a su vez, a nivel genómico debe de haber intercambios recombinacionales que mantengan la secuencia prácticamente idéntica entre ellos.

Lo más lógico hubiera sido la existencia única de una de las cadenas como ocurre en las aves. El hecho del mantenimiento de como mínimo dos cadenas ligeras sugiere la necesidad de preservarlas. La pérdida de una de estas cadenas deberían llevar a la creación de agujeros en el repertorio que en algún determinado momento condicionarían en la viabilidad del individuo. Quizás esto contribuya a la explicación de la aparente " mala inmunidad" de las aves.

Tambien queda la cuestion de si guia una a la otra en la evolución. ¿Es mas fundamental la pesada que la ligera?¿Es mas básica la kappa que la lambda?. El interes de estas cuestiones viene en que si se demostrara la importancia de alguna de ellas sobre las otras implicaría la depencia evolutiva.

400 millones de años, duplicaciones y creatividad

Los peces y los animales que pasaron a tierra llevan 400 millones de años evolucionando de forma independiente. Ademas los ambientes también son totalmente diferentes, unos evolucionan en un medio acuatico y los otros sobre la superficie o el aire.

El sistema inmune con los anticuerpos aparecieron con la generación de los vertebrados hace unos 540 millones de años. La estructura de los anticuerpos de entonces no ha variado considerablente (sobretodo considerando la IgM). Durante 150 millones de años la evolución fué en medios acuáticos y fué entonces cuando algunos animales salieron fuera del agua. Los animales que quedaron en el agua parece que se dedicaron a duplicar los genes de los anticuerpos una y otra vez. En estos procesos de duplicación y recombinación se fueron formando variaciones de la estructura inicial que debieron de ser seleccionadas o no. La teoría de nacimiento y muerte de genes puede aplicarse a estos casos.

En los animales que pasaron a tierra la evolución cambió. Duplicaciones ha habido pero han sido menos frecuentes. Lo que ha tenido éxito han sido las recombinaciones que han creado nuevos genes como la IgA y duplicaciones con evolucion divergente como la IgY y sus derivadas IgG e IgE.

El cuadro que emerge del estudio de los locus genéticos de los anticuerpos evidencia el predominio de las duplicaciones en los genes de los peces y la creatividad de nuevos anticuerpos en los animales que pasaron a tierra.

¿Porque los reptiles han mantenido regiones V durante tanto tiempo?

La teoría de nacimiento y muerte para explicar el origen, la diversificación y la desaparición de regiones V parece que se cumple en la mayoría de las especies. Es muy clara en peces, existiendo algunos casos como el que hemos descrito en el pez espinoso que este proceso debe ocurrir a una gran velocidad. También parece que en mamíferos debe ocurrir un hecho similar ya que hay algunas especies que prácticamente la mayor parte de sus genes V se corresponden con unas pocas familias de un mismo clan. Con estos datos se podría concluir que ha de quedar muy poca memoria de la región V que hubo en los primeros momentos en que se generaron los vertebrados y en el momento en que éstos pasaron a tierra.

Por lo tanto los datos que hemos obtenido de reptiles tanto en la región V de la cadena pesada como la región V de la cadena Lambda son significativos. El hecho de encontrar genes que probablemente no han debido sufrir grandes cambios durante el proceso evolutivo y que además no han sufrido procesos de duplicación nos dan una imagen de cómo debieron ser estos genes en un momento posterior a la salida de los vertebrados a tierra. ¿Porque se han mantenido? cuando estudiamos los peces y describimos que existe una gran velocidad evolutiva en la generación de regiones V propusimos que puede que exista un mecanismo biológico que condicione la diversificación de estas regiones. Una explicación del mantenimiento quizás podría ser que este mecanismo se haya perdido en los reptiles. En realidad la cosa es más complicada ya que junto con regiones V que se han mantenido durante mucho tiempo coexisten otras V que han creado familias con generación reciente.

Otra interpretación posible podría ser la fijación de procesos de respuesta inmune. Me explico. Quizás alguna de las regiones variables tengan una importancia fundamental en la respuesta inmune frente a un germen del ambiente con gran efecto en la supervivencia del reptil. Esta región V no debería ser en ningún momento perdida mientras la amenaza ambiental subsistiera. Además debería haber alguna presión evolutiva para que esta región no se diversificará o se diversificará lo mínimo generando familias de uno o muy pocos miembros.

La primera hipótesis sería necesario demostrar el mecanismo que genera la diversificación de las regiones V mientras que para la segunda trabajo experimental se puede hacer, aunque no en un futuro próximo.

Duplicaciones en el locus IGH y el método de reproducción

Tanto en el pez espinoso como en el medaka existen procesos de duplicación génica que han ocurrido recientemente. Estas duplicaciones que hemos encontrado en los genes para los anticuerpos puede que sea un proceso que ocurra en otros genes. Un proceso de esta magnitud parece que no se corresponde con lo encontrado en las especies que pasaron la tierra. En mamíferos podemos encontrar duplicaciones recientes de un gen concreto de anticuerpos (IgG en humanos o IgA en conejos) pero no divisiones sucesivas y aditivas del locus y IGH completo.

Aunque se puede argumentar que el locus IGH en humanos se ha duplicado en periodos relativamente recientes, esto no es comparable con lo que hemos encontrado en los peces anteriormente mencionados. La duplicación en el locus humano ocurrió una sola vez y ha habido cambios importantes, encontrando la secuencia totalmente cambiada en las zonas intronicas y abundantes cambios en los exones de los anticuerpos que quedaron viables. En los peces las secuencias de los segmentos duplicados son prácticamente idénticas sugiriendo que la duplicación es extraordinariamente reciente.

¿Cómo podemos explicar estos procesos de duplicación tan frecuentes en peces?. La solución puede que esté en el método de reproducción. Los peces se reúnen produciendo un enorme desove de millones de huevos que a su vez se juntan con machos que producen millones de espermatozoides. En este proceso de fecundación se producirán millones y millones de zigotos sobre los que actuará la selección natural. El hecho de que en cada acto reproductivo se produzca una prole tan inmensa evidencia que muchos individuos presentarán variaciones genéticas que serán testadas por el ambiente y a su vez seleccionadas. Por lo tanto los procesos evolutivos que tienen que ser mucho más rápidos en peces que en mamíferos. Estos últimos generan una prole mínima la cual es ayudada por sus progenitores a sobrevivir. Es evidente que el mecanismo evolutivo en los animales terrestres y acuáticos cambian a partir de que cambian los métodos reproductivos.

La generación de la diversidad de los anticuerpos en reptiles

En aves y mamíferos existe una diferencia sustancial en la generación de especificidades de los anticuerpos. En mamíferos la creación de esta diversidad está muy estudiada. Se basa fundamentalmente en la elección aleatoria de genes V, D y J. Este proceso ocurre tanto en las cadenas pesadas como en las cadenas ligeras. Los mamíferos tienen dos cadenas ligeras diferentes (kappa y lambda) mientras que las aves únicamente tienen cadenas ligeras lambda.

En las aves cada una de las cadenas del anticuerpo solamente utiliza una región V. esta región V es diversificada por procesos de recombinación con regiones V que se encuentran "upstream" de la usada. Este fenómeno ocurre tanto en las cadenas pesadas como en la cadena ligera.

Los reptiles van a utilizar el sistema de mamíferos. Además presentan las mismas cadenas ligeras que tienen los mamíferos. Por lo tanto el sistema de diversificación de los anticuerpos de las aves es propio de ellas y no ha sido delegado de los reptiles.

Otros procesos de diversificación como la unión desigual V-D-J, la adición de nucleótidos N y P y la mutación somática también se pueden estudiar. En principio con los datos presentes en el genebank creemos que podemos hacer el estudio detallado y responder a la pregunta de si los procesos de diversificación más sofisticados de los mamíferos estaban ya presentes en los reptiles.

Mas VH en Anolis carolinensis

En el estudio que hicimos del locus IGH de Anolis carolinensis encontramos 61 regiones VH. En el scalfold 731 fue donde encontramos la mayoría de ellas. Debido a que en los extremos encontramos genes que ya no correspondían a genes de anticuerpos creímos que aquí acababa el locus. Ha sido una sorpresa al revisar los datos de que pasados varios genes para el receptor vomeronasal siguen apareciendo genes VH. A día de hoy he encontrado unos 40 genes adicionales. Por lo tanto habrá que hacer una segunda versión del mapa y reeditar todas las secuencias y comprobar la composición de los grupos y familias de regiones VH.

Es importante estudiar cómo se genera la diversidad de los anticuerpos en lo reptiles. Existen bastantes indicios de que los genes de los anticuerpos de estos animales no han cambiado mucho en los últimos 300 millones de años. Las VH de los mamíferos se han generado muy recientemente y no quedan restos de aquellas que les debieron dar origen. Algunas de las VH de Anolis carolinensis parece que se corresponden con aquellas que existían en los tiempos en que se generaron los reptiles.

Las VL de las aves

En el pollo se ha descrito la generación de la diversidad de los anticuerpos mediante un proceso particular. Tanto en las cadenas pesadas como las cadenas ligeras solamente existe un gen VL viable. El resto de los genes variables se consideran pseudogenes que donan parte de su secuencia para generar la diversidad mediante recombinación con el gen VL viable. A pesar de que este hecho esta muy descrito en el pollo no está claro si va a ocurrir lo mismo en todas las especies de aves. También se producen cuestiones evolutivas. Un pseudogen tiene un tiempo de vida evolutivo limitado debido a la imposibilidad de expresarse. Esto condiciona la no selección de esta secuencia con permisividad para mutaciones y delecciones que acabaran borrando el gen.

Las aves parece que solamente tienen cadenas ligeras Lambda. Esto nos puede ayudar para reestudiar este fenómeno en la actualidad con los locus completos del pollo y el zebra finch. Además otra cuestión que queda pendiente es si la capacidad de generación de diversidad en el pollo se ha generado en la línea evolutiva de las aves o es heredado de los reptiles. En los reptiles hemos encontrado que presentan cadenas kappa y lambda. Su descripción y análisis detallado en los siguientes días nos darán la solución.

Como hacer investigación

Hay un cambio en la metodología de investigación. Los trabajos de laboratorio siempre han conllevado la necesidad de una gran cantidad de aparataje, reactivos y manipulación para la realización experimentos. La mayor parte del tiempo es dedicada a la realización del experimento mientras que la actividad intelectual de su preparación y análisis duraban menos. En la actualidad con la aparición de la automatización de los laboratorios y nuevas máquinas que generan enormes masas de datos se crea una nueva actividad investigadora mucho más fácil y satisfactoria. En estos momentos se están generando muchos más datos de los que el sistema puede analizar. Además esta situación tiene visos de perdurar sobre todo en biología ya que en los siguientes años probablemente puedan ser secuenciados (su DNA) de todos los seres vivos.

Parece que en otras ciencias también está ocurriendo lo mismo. En física y astronomía todos los datos que se obtienen de observaciones son introducidos igualmente en Internet.

Una visión inteligente de aquel que se incorpora a las labores de investigación debería aprovecharse de esta situación. Los datos están en Internet y el aprendizaje de su obtención y manipulación le darían una gran ventaja. Si continúa por el método clásico no le queda más camino que realizar un duro trabajo para obtener financiación y la ejecución experimental de laboratorio, siendo necesario probablemente tres años de trabajo para obtener uno o dos artículos con suerte.

¿Se cumple la teoría de la selección clonal en teleósteos?

Parece que en muchas especies de peces teleósteos existen más de un locus IGH. A pesar de que muchos de los genes parece que van a ser pseudogenes puede que existan más de una IgM funcional. Además es posible que ocurran varios procesos de reagrupamiento asociados a cada una de las zonas en que se encuentran las VH-DH-JH. Esto conlleva a la idea de que un mismo linfocito podría expresar dos anticuerpos diferentes.

Uno de los conceptos básicos en que se sustenta la teoría de la selección clonal es el de una célula un anticuerpo. Tardó muchos años en demostrarse pero al final quedó claro. Desde luego en humanos y en roedores está muy demostrado. Desde que este concepto fue asimilado. inconscientemente lo hemos aplicado a todo el proceso evolutivo de los anticuerpos, pero quizás algunas líneas evolutivas lo podrían haber perdido como en el caso de los peces teleósteos. En aquellos peces en que se demuestre la existencia de dos IgM funcionales es necesario hacer experimentos para confirmar si se producen más de un reagrupamiento génico y si a la vez se conforman más de un anticuerpo por celula.

Cambio genómico inducido

Para que los seres vivos puedan evolucionar es necesario que ocurran cambios en su genoma. Existe un consenso de que los cambios fundamentales en los genes son la mutación y los procesos de recombinación que conllevan a duplicaciones y conversiones génicas. Además puede que los trasposomas también intervendrán en los procesos de duplicación génica.

Los cambios en el genoma siempre se han considerado un proceso accidental estocástico. La mutación somática siempre se ha descrito como un proceso aleatorio que tiene una tasa de ocurrencia por unidad de tiempo. Los procesos de duplicación génica igualmente son considerados accidentes mayores. Todos estos accidentes curiosamente se consideran los actos fundamentales de la evolución. Sobre las nuevas formas fenotípicas que generen estos cambios del genoma actuará la selección natural, que condicionará el mantenimiento o la desaparición de lo originado tras el accidente.

Por lo tanto es difícil pensar que haya cambios genéticos programados o estructurados en la actividad biológica de los seres vivos (esto sería lo contrario a lo accidental o casual). Sin embargo dentro de la propia teoría evolutiva se considera que la diversidad es necesaria para que exista evolución. Contra mayor diversidad mayor evolución se desarrolla. Por lo tanto sería lógico pensar que la propia selección natural condicionará la existencia de procesos de variación genética que dieran diversidad a grupos de seres vivos. Así podrían ocurrir cambios genéticos a consecuencia de mecanismos biológicos existentes en los propios seres vivos que facilitarán una evolución adaptativa. Esto último es muy factible que esté ocurriendo en la zona genética que codifica para la regiones VH. Lo que hemos visto en el pez espinoso de la generación rápida de un repertorio podría ser un paradigma de este fenómeno. Sería interesante estudiar y buscar si hay algo encerrado en las secuencias de estas zonas para poder intentar deducir el proceso biológico subyacente.

Normas evolutivas

Durante muchos años la evolución se consideró consecuencia de pequeños cambios genéticos accidentales, que posteriormente entran en el proceso de selección natural. Cuando se descubrió la mutación somática, ésta engranó perfectamente con estas ideas y con los conceptos gradualistas en la evolución. Así un gen que codifica a una proteína irá sufriendo mutaciones, algunas de las cuales (la mayoría) son irrelevantes, mientras que un pequeño número tendrán efectos beneficiosos o negativos dentro del contexto selectivo. Prácticamente la base genética de la evolución se basó en esta concepción.

La secuenciación de numerosos genes evidenció la presencia de las familias supergénicas. Estas familias únicamente se pueden entender como consecuencia de un proceso de duplicación de genes durante la evolución. Estos datos ya indican procesos de cambio nivel del DNA muy superiores a los predichos exclusivamente por la mutación. En los últimos años con la secuenciación de los genomas se ha añadido la presencia de los transposomas. Probablemente estas secuencias deben ayudar al proceso de recombinación y duplicación de genes.

En los peces teleósteos se evidencian procesos de duplicación múltiples de los anticuerpos. En la línea evolutiva de los animales terrestres, los procesos de duplicación parecen ser más esporádicos. A pesar de eso se podrían llegar a conclusiones de que en el proceso evolutivo de los anticuerpos existen una serie de normas o leyes que nunca se han alterado. Una primera norma es clara:

- Todos los vertebrados presentan IgM (anticuerpo con cuatro dominios inmunoglobulina con segmentos JH en su región 5').

Una segunda norma también es clara aunque más difusa:

- Todos los vertebrados presentan un anticuerpo en la región 3' de la IgM.

Una tercera:

- Los los genes de los anticuerpos tienden a combinarse o duplicarse generándose nuevos anticuerpos. Este proceso siempre ha de dejar una IgM integra, mientras que el resto que los anticuerpos puede variar ampliamente.

¿Porque todo esto es así?. La IgM debe jugar un papel principal. Todos los procesos que condicionen su eliminación son letales. No ocurre lo mismo con el resto de anticuerpos, pudiendo estos combinarse para generar otros anticuerpos que pudieran dar ventajas evolutivas. Estas no tienen que ser obligatorias para el mantenimiento de la viabilidad del individuo sino que le dan una ventaja evolutiva que facilitan su supervivencia.

la baraja de exones en el medaka

El locus IGH del medaka parece complejo y confuso pero puede que todo sea simple. Lo de complejo y confuso viene por el hecho de que se encuentran numerosos exones para codificar genes de cadenas constantes, pero no queda claro que el conjunto de estos exones puedan codificar un anticuerpo real. La situación es tan confusa que es mejor clasificar las 500,000 pares de bases que componen el locus en zonas. Existen cinco zonas claramente delimitadas con exones que codifican para las regiones constantes de anticuerpos. En estas zonas hay exones para codificar una o dos IgM y probablemente una IgD. Pongo una figura con el esquema de la Zona 2 que es muy similar al resto que los otras 5 zonas. Como puede verse detrás de tres exones de IgM hay un exon de IgD y de nuevo vuelve haber exones de IgM y de nuevo exones de IgD. La conclusión es que varios de estos exones parecen haberse barajado. A pesar de toda esta organización de exones no he podido encontrar ninguna EST con estas secuencias, indicando que probablemente la Zona 2 no codifique a ningún anticuerpo real.

Ha habido por lo tanto procesos de duplicación y recombinación múltiples que no han debido generar una organización genética viable para producir un anticuerpo real. Este proceso ha ocurrido hace tan poco tiempo que los exones tienen secuencias idénticas no existiendo ninguna mutación. Por lo tanto no llegan a ser funcionales probablemente porque se han perdido secuencias regulatorias o estructurales necesarias para el proceso de transcripción.

IgM especial en el medaka

Una mirada general al locus IGH del medaka (Oryzias latipes, en la imagen únicamente un trozito del locus) evidencia una distribución de los genes de los anticuerpos y exones que va a ser difícil de interpretar. Existe procesos de duplicación de largos segmentos de la secuencia y parece que ahí únicamente dos clases de anticuerpos IgM e IgD (aunque puede haber tres o cuatro isotipos de cada una de ellas). Pero tanto la IgM como la IgD tienen peculiaridades.

Existe una IgM de aspecto normal con cuatro dominios de inmunoglobulinas y que supongo que será la fundamental del pez (no es la expresada en el gráfico). A su vez existen otros genes conformados por dominios de inmunoglobulina de IgM pero son genes con únicamente tres dominios (sería el primer caso de una IgM de tres dominios). La cosa se complica cuando he determinado que el dominio que falta es el CH3 (en un anticuerpo siempre que falta un dominio el ausente es el CH2). Para complicar más la cosa he buscado las base de datos EST y encontrado que el RNA mensajero de estos genes de tres dominios de IgM solamente tienen dos (los correspondientes a los dominios CH1 y CH2). Así que el gen de la "IgM especial" del medaka (quizás haya que ponerle un nombre propio) está conformado por dominios de IgM 1, 2 y 4. Además tras ellos existe en dos dominios trasmembrana (sorprendentemente cada uno de los dominios codifica para una hélice alfa hidrofóbica). Este gen genera un RNA mensajero con los dominios 1, 2, TM1 y TM2. Este anticuerpo no se parece a ningún otro anticuerpo publicado. Todas las EST que encontraron son de membrana (parece que no existe forma secreta). Tampoco he encontrado ninguna EST que tuviera el dominio 4.

La cosa no acaba aquí. Existen en el locus dominios de IgM sueltos o interpuestos entre los dominios de la IgD. La conclusión que saco de forma provisional es que en este locus ha debido ocurrir recientemente una catástrofe con un gran número de recombinaciónes en la cual se han destruido y se han creado nuevos genes. Probablemente debió de ocurrir hace poco tiempo y no ha dado tiempo a la mutación estocástica evolutiva a ir borrando los exones que han caído dentro de zonas no codificantes. Es la única forma de poder explicar la existencia de exones perfectos pero que no pasan a RNA mensajero.

Es necesario algo de tiempo para madurar estas ideas o cambiarlas. El estudio no está en absoluto completo.

Duplicaciones en el locus IGH del medaka

Al igual que en el pez espinoso en el medaka también existen un gran número de duplicaciones de amplios segmentos de DNA genómico dentro del locus genético de las cadenas pesadas de los anticuerpos. Estas duplicaciones son recientes y han generado un gran número de isotipos de los cuales algunos de ellos puede que no sean funcionales. Más aún, en el medaka, parece que el proceso ha sido caótico. Aparecen IgMs con tres dominios en los que se ha perdido el CH3 (hasta ahora no existe otro ejemplo en la literatura) y además ahí exones sueltos que probablemente no se expresen en RNA mensajero. La explicación de estos exones sueltos es sugestiva de una generación muy reciente y que no han existido tiempo para inducir cambios mutacionales significativos. Por lo tanto en el estudio del locus genético del medaka va a ser muy importante saber cuál de los isotipos son realmente funcionales y significativos en la respuesta inmune. Por otro lado nos puede ayudar a entender lo que ocurre en los procesos evolutivos. Debido al amplio número de duplicaciones y la generación de diferentes formas de isotipos se puede deducir las formas posibles que puede tener un anticuerpo. Sobre esto hay datos interesantes que se mencionaran en otros post.

¿Porque el pez espinoso y el medaka tienen triplicaciones en el locus IGH?. Una explicación podría ser que el proceso de tiplificación hubiera sido único y ocurriera antes de la divergencia de las dos especies. Esto no puede ser posible..... las diferencias de secuencia en cada una de las clases de anticuerpos entre las dos especies son mayores que las diferencias de secuencia entre los isotipos de la misma especie. La conclusión que se obtiene es que el proceso de triplicación ha ocurrido de forma independiente en cada una de las dos especies. Por lo tanto la tendencia a la multiplicación de los anticuerpos es un proceso que abarca por lo menos a estas dos especies y queda descartado que sea un acto estocástico casual. ¿Tiene algo que ver el proceso biológico que induce la diversificación de las regiones VH?. Quizás un análisis detenido nos pueda ayudar a contestar estas preguntas.

Una paradoja evolutiva en la IgM

He estado buscando el origen evolutivo de la IgT/Z. En un principio me pareció muy plausible que se correspondiera con una duplicación simple de la IgM. El hecho de que también tenga regiones J apoyaría esta sospecha. Para confirmarla obtuve múltiples secuencias IgM desde peces cartilaginosos hasta mamíferos. A todas las secuencias eliminé la secuencia correspondiente a la codificada por el exón CH1 ya que tenemos una sospecha clara de que este exón es intercambiado durante el proceso evolutivo.

El árbol filogenético tal como sale no confirma la hipótesis anteriormente mencionada. El árbol también da resultados conflictivos. El más sorprendente es que la IgM de los animales terrestres procede evolutivamente de la IgM de los peces cartilaginosos. Esto podría indicarnos que es una falsedad inducida por el árbol, pero el problema que tengo es que hay otros datos que apoyan esta hipótesis. Los datos proceden del estudio de la IgD. La IgD de los peces teleósteos parece que no tiene relación evolutiva con la IgD de los animales terrestres, y en cambio la IgW y IgNARC si que la tienen. Además el pez pulmonado tiene IgW. Otro dato que confirma lo anterior es el hecho de que la IgY también parece proceder de los cuatro primeros dominios de la IgW. Tambien la IgM del pez pulmonado se coloca perfectamente entre la IgM de los cartilaginosos y los animales terrestres.

Las bases de datos EST

Cuando empezamos a realizar el estudio del locus IGH de Eublepharis macularius todo lo teníamos que hacer nosotros. Extraer DNA y RNA, realizar PCRs y RT-PCRs y posteriormente secuenciar los productos. Ahí no acababa el trabajo; las secuencias fueron sometidas al paso por múltiples softwares para sacar la información relevante.

En la actualidad ha cambiado todo. El trabajo manual y experimental de laboratorio ha desaparecido. Gente con impresionantes máquinas secuencian el genoma completo de diferentes especies y dejan estas secuencias para su uso público. Incluso esta secuencias son introducidas y pasadas por diferentes softwares intentando sacar la información relevante. En la actualidad sólo queda una cosa que es lo que estamos haciendo nosotros. Personas que tienen conocimientos sobre el tema revisan los datos y ordenan la información para la realización de la publicación científica.

Hago esta reflexión debido a que he introducido en los estudios las bases de datos EST. En el trabajo experimental que realizamos con Eublepharis macularius una de las partes más complicadas era el trabajar con RNA. Esto lo hacíamos para ganar confianza en las predicciones génicas que habíamos hecho a partir de las secuencias del DNA genómico. Como todos los genes eran definidos informáticamente era necesario la secuencia del RNA mensajero para confirmar los límites exón-intron y las diferentes formas probables del gen. En la actualidad la totalidad de proyectos de secuenciación de un genoma se acompaña de una secuenciación de EST (en realidad no sé lo que significan estas siglas). Lo que sí he visto es que son secuencias de cDNA de diferentes tejidos. Por lo tanto para nosotros esto cierra el círculo. Podemos hacer el estudio de un locus genético identificando los genes informáticamente y posteriormente confirmar estas predicciones mediante el estudio de las secuencias ESTs del proyecto. En una palabra han logrado hacer digital una cantidad enorme de trabajo manual

El medaka (Oryzias latipes)

Ya hemos llegado al final del estudio de G. aculeatus. En él hemos descrito una nueva forma de la IgT y sus orígenes evolutivos y además hemos evidenciado la existencia de un mecanismo biológico que induce la diversificación de los genes VH. Comenzamos el estudio con otro pez llamado "Medaka" (Oryzias latipes). Es un pez muy pequeño del sudeste asiático y habita tanto ríos como océanos. Puede que tenga una distancia evolutiva de aproximadamente 180 millones de años respecto al pez espinoso lo cual puede poner a prueba las hipótesis que hemos realizado con este último sobre la evolución de los anticuerpos. He localizado en el cromosoma ocho el locus IGH. Tiene un tamaño muy grande e igualmente se encuentran barajadas las regiones constantes y las regiones VH. En un primer análisis y ya se detectan zonas de interés. Tiene una combinación de IgZ más IgD sin la presencia de IgM (nunca se había descrito este hecho). Además aparecen unas IgD  extremadamente cortas con solamente tres dominios de inmunoglobulina. También hay una IgD muy larga pero existe un "exon suffling" de la IgM........ etc... Tenemos mucho trabajo para poder entender lo que hay en este locus.